北冬蟲(chóng)夏草MAT1-1-1基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Cmgpd)的克隆和分析.pdf

1、子囊菌(Ascomycetes)是真菌門(mén)中最大的一綱,本綱最重要的特征是產(chǎn)生子囊(ascus),內(nèi)生子囊孢子(ascospore)。子囊是兩性核結(jié)合的場(chǎng)所,結(jié)合的核經(jīng)減數(shù)分裂,形成子囊孢子；其有性生殖過(guò)程的研究已有80多年。子囊真菌可根據(jù)形態(tài)差異分成兩組：一組是單核酵母,而另一組是絲狀真菌。在所有真菌中,眾所周知的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值,被廣泛用于面包制作、發(fā)酵和釀酒。在絲狀子囊菌中,冬

2、蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis)是一種絲狀真菌,在中國(guó)已經(jīng)作為一種中藥被廣泛使用了幾個(gè)世紀(jì)。北冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps militaris)作為冬蟲(chóng)夏草的替代品也是一種蟲(chóng)生真菌,同樣含有很多生物活性成分,例如蟲(chóng)草素(3’-脫氧腺苷)、蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草多糖等。在本研究中,通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)和苯酚-硫酸法分別檢測(cè)了冬蟲(chóng)夏草和北冬蟲(chóng)夏草的各個(gè)部分中蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖的含量。結(jié)果表明：北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中的蟲(chóng)草素含量為1.

3、137%,北冬蟲(chóng)夏草菌絲體中的蟲(chóng)草素含量為0.7162%,冬蟲(chóng)夏草中的蟲(chóng)草素含量為0.000523%；北冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中的蟲(chóng)草多糖含量為3.35%,北冬蟲(chóng)夏草菌絲體中的蟲(chóng)草多糖含量為3.05%,冬蟲(chóng)夏草中的蟲(chóng)草多糖含量為7.83%。子囊真菌的菌種改良主要依靠隨機(jī)突變法或經(jīng)典的遺傳育種法,從而篩選出目的特性改良了的突變體或雜交后代。實(shí)驗(yàn)室中真菌交配是遺傳分析和菌種改良的有利工具。在異宗交配的子囊真菌中,典型的交配只能在形態(tài)相同而交配型不同

4、的配偶菌株間進(jìn)行,而交配型可分為MAT1型和MAT2型。通常MAT1型和MAT2型由單個(gè)交配型位點(diǎn)MAT1決定,因?yàn)镸AT1位點(diǎn)上的等位基因沒(méi)有相似性,所以這樣的等位基因又被稱為“獨(dú)特型”(idiomorph)。MAT1型和MAT2型的獨(dú)特型分別為MAT1-1和MAT1-2。盡管等位基因MAT1-1和MAT1-2的核苷酸序列相似性很低,但是MAT1-1和MAT1-2的兩端側(cè)翼序列具有高度同源性。子囊真菌的交配型等位基因編碼含已確定或推測(cè)

5、的DNA結(jié)合基元的蛋白。這些蛋白作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,控制特異細(xì)胞的形成和有性形態(tài)的形成的途徑。對(duì)于交配型的分子特性的充分理解將能降低菌種育種過(guò)程中所需花費(fèi)的勞動(dòng)力。通過(guò)基于PCR的交配型測(cè)試,證明本實(shí)驗(yàn)室保存的北冬蟲(chóng)夏草的交配型是MAT1型。雖然已有北冬蟲(chóng)夏草MAT1-1等位基因的部分DNA序列報(bào)道,但是北冬蟲(chóng)夏草交配型基因MAT1-1-1的3’端序列仍然是未知的。所以通過(guò)熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal Asymmetric I

6、nterlaced PCR,TAIL-PCR)技術(shù),擴(kuò)增了北冬蟲(chóng)夏草的MAT1-1序列全長(zhǎng)。結(jié)果表明等位基因MAT1-1上含有兩個(gè)交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2,但是在MAT1-1-1基因和MAT1-1的3’端側(cè)翼區(qū)域中間,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它潛在的基因。北冬蟲(chóng)夏草的交配型位點(diǎn)上的MAT1-1的基因組織結(jié)構(gòu)與另一個(gè)同科蟲(chóng)生真菌高雄山蟲(chóng)草(C. takaomontana)相似。另一方面,植物病原真菌瘤座菌屬(Balansia)的菌

7、種,麥角菌(Claviceps purpurea )和稻香柱菌(Epichloe typhina)同屬于麥角菌科,其與蟲(chóng)草菌科的關(guān)系非常近,然而這些真菌除了含有MAT1-1-1和MAT1-1-2基因外還含有另外一個(gè)交配型基因MAT1-1-3。這些結(jié)果暗示麥角菌科的植物病原真菌可能是蟲(chóng)草菌科的蟲(chóng)生真菌的較早的祖先,可能在從植物進(jìn)入動(dòng)物的宿主遷移中丟失了MAT1-1-3基因。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phos

8、phate dehydrogenase,GPD)基因的啟動(dòng)子被廣泛用于驅(qū)動(dòng)真菌中目的基因的組成型表達(dá)。然而,真菌的啟動(dòng)子具有種屬的特異性,一些實(shí)驗(yàn)證明異源啟動(dòng)子具有較低的驅(qū)動(dòng)活性。為了獲得一種高效、穩(wěn)定的啟動(dòng)子應(yīng)用于將來(lái)的北冬蟲(chóng)夏草的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),本研究利用TAIL-PCR技術(shù),成功克隆了北冬蟲(chóng)夏草GPD基因全長(zhǎng)(Cmgpd)。RT-PCR分析表明北冬蟲(chóng)夏草GPD基因是表達(dá)的,同時(shí)驗(yàn)證了其推測(cè)的僅有內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄中已被去除。通過(guò)生物信息學(xué)分析