pseudomonassp.m亞磷酸脫氫酶基因的克隆、表達(dá)和酶性質(zhì)的研究

1、浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文Pseudomonas sp.M亞磷酸脫氫酶基因的克隆、表達(dá)和酶性質(zhì)的研究姓名：杜怡青申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：趙宇華20100101浙江大學(xué)碩十學(xué)位論文A b s t r a c tP h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e i n v o l v e d i nt h em e t a b o l i s m o f p h o s p h i

2、 t e i no r g a n i s m s ，i t c a t a l y z e do x i d a t i o n o f p h o s p h i t ec o u p l e dw i t hr e d u c t i o no fN A D ( P ) + t o g e n e r a t eN A D P H ．I n t h e c o m m o nu s e d c o e n z y m e r e

3、g e n e r a t i o n s y s t e m ，t h e p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e h a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sl o w K m ，a l m o s tn or e v e r s er e a c t i o n ，h i g hc o n c e n t r a t i o no f t h ep

4、 r o d u c tp h o s p h a t ed o e s n o ti n h i b i tt h er e a c t i o n ．w i d ep Hs t a b i l i t y e r e ．，t h e s ep r o p e r t i e sb r i n ga b o u t h i g h e ru s i n gv a l u ea n d b r o a da p p l i c a t

5、i o np r o s p e c ti nc o e n z y m e r e g e n e r a t i o n p r o c e s so f i n d u s t r i a lb i o c a t a l y s i s ．I n t h i s d i s s e r t a t i o n ，w e s t a r t e d f r o m h o m o l o g o u s s e q u e n c

6、 e s o f p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e s ，u s i n gs o m eb a c t e r i a p r e s e r v e d i n o u rl a b o r a t o r y a s t h e t a r g e t ，c l o n e dp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e g e n e f

7、 r o m P s e u d o m o n a ss p ．M s t r a i nb ym o l e c u l a rb i o l o g y m e t h o d ，c o n s t r u c t e d r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n p l a s m i d o f p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e g

8、e n e ，f i n a l l y g o t t h er e c o m b i n a n t p h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s e b yi n d u c i n ge x p r e s s i o na n d a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yp u r i f i c a t i o n ，a n dt h e n

9、w e s t u d i e dt h ed e t a i l e dp r o p e r t i e so f t h i sp h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s e ．T h e p h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s e g e n ec o n s i s t so f 10 1lb p n u c l e o t i d e se

10、n c o d i n gap e p t i d e o f 3 3 6 a m i n oa c i dr e s i d u e s ．T h eu p s t r e a m g e n ew a s p t x Ca n d d o w n s t r e a mg e n e w a s p t x Ei n d i c a t e d t h a tt h e p h o s p h i t e d e h y d r o

11、 g e n a s e g e n e W a ss i t u a t e di np t x A B C D E o p e r o n ，w h i c h i sh o m o l o g o u si nP s e u d o m o n a s s t u t z e r i W M 8 8 ．R e c o m b i n a n t p h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s e

12、w a s p u r f i e d b y N i - N T A a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ．T h e p u r i f i e dp h o s p h i t e d e h y d r o g e n a s e d i s p l a y e da s i n g l eb a n di nS D S - P A G E ．C o m p a r e d w

13、i t h t h es t a n d a r dp r o t e i n m a r k e r , m o l e c u l a r w e i g h t o f t h er e c o m b i n a n te n z y m e s w a s c a l c u l a t e da s3 5 k D a ．T h ep r o p e r t i e so ft h i s r e c o m b i n a

14、n tp h o s p h i t ed e h y d r o g e n a s eW a si n t e n s i v e l ys t u d i e d ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t ：T h eo p t i m u m t e m p e r a t u r e w a s 4 0o C ，a f t e r t r e a t i n ga t d i f f e

15、 r e n tt e m p e r a t u r e sa t p H7 ．0 i n M O P S b u f f e rf o r 3 0 m i n ，r e s i d u a le n z y m ea c t i v i t yw a sm e a s u r e da n dw ef o u n d t h a tt h er e c o m b i n a n te n z y m e i s m o s ts

16、t a b l eb e l o w 4 0 。C ；i t ’So p t i m a l p H v a l u e i s7 ．0 ，a f t e rt r e a t e da td i f f e r e n tp H a t2 5 。Cf o rlh ，w e m e a s u r e dt h er e s i d u a le n z y m e a c t i v i t ya n df o u n d t h a