Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脫氫酶和木糖醇脫氫酶基因的克隆及協(xié)同表達.pdf

1、木糖醇因其甜度高、熱量低且代謝不受胰島素影響等特性而備受關注，在食品、醫(yī)藥和化工等領域得到廣泛應用，在國際市場上供不應求。近年來，隨著綠色發(fā)展和可持續(xù)發(fā)展理念越來越深入人心，人們的環(huán)保意識增強，生物法生產木糖醇逐漸成為各國學者開展研究的重點。D-阿拉伯糖醇脫氫酶（ D-arabitol dehydrogenase, ArDH）和木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase, XDH）作為木糖醇生物合成途徑中的關鍵酶和限速酶，

2、它們的高效表達對 D-阿拉伯糖醇轉化生產木糖醇起著至關重要的作用。因此，構建高性能的基因工程菌，對于木糖醇生產效率的提高以及工業(yè)化生產具有重要的意義。
　　本論文利用PCR技術從泰國葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter thailandicus）中擴增出 ArDH的編碼基因 ardh，構建重組質粒 pET28a-ardh，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中得到了高效表達；ardh的表達產物經(jīng)S

3、DS-PAGE分析顯示有27kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)，純化蛋白并測定其酶學性質。當以D-木酮糖為底物時，還原反應的最適溫度為30℃，最適pH約為5.0，還原反應的比活為11.46U/mg，對D-木酮糖的Km值為27mmol/L，Vmax為22.3μmol/min/mg；當以D-阿拉伯糖醇為底物時，氧化反應最適溫度為30℃，最適pH約為9.0，氧化反應的比活為27.72U/mg，對 D-阿拉伯糖醇的Km值為12.5mmol/L，Vmax為

4、52.8μmol/min/mg。
　　同時，克隆并表達了來自G. thailandicus的XDH的編碼基因xdh，構建重組質粒 pET28a-xdh，并在大腸桿菌（ E. coli） BL21(DE3)中得到了高效表達。SDS-PAGE分析結果顯示重組菌BL21(DE3)-xdh有28kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)。經(jīng)過金屬鎳親和層析及 Sephacryl S-300凝膠層析純化后，系統(tǒng)地測定其酶學性質。當以D-木酮糖為底物時，還原反

5、應的最適溫度為30℃，最適pH約為5.0，還原反應的比活為126.3U/mg，對 D-木酮糖的Km值為11.2mmol/L，Vmax為134.2μmol/min/mg；當以木糖醇為底物時，氧化反應最適溫度為35℃，最適pH約為11.0，氧化反應的比活為28.6U/mg，對木糖醇的Km值為78.6mmol/L，Vmax為53.6μmol/min/mg。
　　利用重組質粒pET28a-xdh和pET28a-ardh構建重組質粒pET2

6、8a-xdh-ardh，并轉入 E. coli BL21(DE3)，實現(xiàn)了 xdh和 ardh基因的協(xié)同表達。對重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh和原始菌G. thailandicus分別進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵結果表明重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh的木糖醇產量為23.7 g/L，原始菌G.thailandicus的木糖醇產量為12.9 g/L。重組菌從D-阿拉伯糖醇到木糖醇的轉化率為29.6％，相較于原始菌從D-阿拉伯糖