香蕉乙醇脫氫酶基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、香蕉是世界上最重要的水果之一,被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織確定為世界第四大糧食作物。在香蕉生長(zhǎng)發(fā)育過程許多逆境,如澇害,低溫等都會(huì)影響都香蕉苗的生長(zhǎng)發(fā)育,從而影響了香蕉果實(shí)的產(chǎn)量;香蕉果實(shí)是一種典型的呼吸躍變型果實(shí),其采后成熟過程關(guān)系著香蕉果實(shí)的品質(zhì)和貨架期的長(zhǎng)短。乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH,E.C.1.1.1.1.)廣泛分布于各類植物器官組織中,與植物逆境生理、植株生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)采后成熟衰老和芳香物質(zhì)的生物合成

2、等過程密切相關(guān)。因此研究乙醇脫氫酶和香蕉幼苗的逆境生長(zhǎng)以及香蕉果實(shí)的采后成熟之間的關(guān)系,為我們培育更加具有抗逆性的香蕉品種以及發(fā)展改良創(chuàng)新采后保鮮和催熟技術(shù)具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室于2003年采用抑制差減雜交的方法在香蕉采后成熟早期差異表達(dá)的低豐度cDNA序列,獲得289個(gè)克隆。BlastX顯示,有一個(gè)500bp的片段和其他植物的ADH基因相似性很高,為此我們?cè)O(shè)計(jì)兼并引物對(duì)ADH基因進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增,PCR電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩條很

3、特異的帶,測(cè)序結(jié)果表明,他們都屬于ADH家族,分別命名為MaADH1和MaADH2。在此基礎(chǔ)上,我們采用RACE技術(shù)從香蕉果實(shí)cDNA文庫(kù)中分離獲得MaADH2 cDNA全長(zhǎng),經(jīng)序列測(cè)定和同源性分析表明,該cDNA全長(zhǎng)為1140bp,含完整的開放閱讀框,編碼379個(gè)氨基酸殘基,BlastX分析表明,該cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與擬南芥、蓖麻、水稻有較高的一致性,(92％、92％、91％)。保守結(jié)構(gòu)域分析表明,MaADH2含有ADH N s

4、uperfamily和NADB_Rossmarm superfamily兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)位點(diǎn),這與典型的ADH基因的結(jié)構(gòu)域相符。采用RT-PCR的方法對(duì)其在香蕉各器官的表達(dá)情況分析表明,該基因在香蕉的根、莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)。其中,莖、葉、花、果的表達(dá)量較低并且差異不明顯,根中的表達(dá)量較高。所以,MaADH2可能在香蕉不同的生長(zhǎng)發(fā)育中起作用。
　　 為研究MaADH2與香蕉采后乙烯生物合成的關(guān)系,在正常成熟、乙烯誘導(dǎo)成熟和1-

5、MCP抑制成熟的條件下,測(cè)定了香蕉果實(shí)采后不同階段的乙烯釋放量并采用熒光定量PCR的方法研究了MaADH2在香蕉果實(shí)采后不同成熟階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明,乙烯在誘導(dǎo)果實(shí)成熟時(shí)并沒有誘導(dǎo)MaADH2基因的表達(dá)量上升,而1-MCP在抑制成熟時(shí),并沒有隨著內(nèi)源乙烯被抑制而MaADH2基因的相對(duì)表達(dá)量下降。
　　 為了研究MaADH2與香蕉果實(shí)外源ABA之間的關(guān)系,在正常成熟,ABA誘導(dǎo)成熟的條件下,用熒光定量PCR的方法研究了MaAD

6、H2在香蕉果實(shí)采后不同成熟階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明,ABA推遲了MaADH2的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值的時(shí)間。
　　 為了研究香蕉幼苗在逆境脅迫下MaADH2的表達(dá)情況,采用RT-PCR方法研究了該基因在傷害脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫下的表達(dá)情況;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究了該基因在干旱脅迫及澇害脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果表明:傷害脅迫條件下,MaADH2基因在香蕉幼苗葉片中下調(diào)表達(dá);鹽脅迫條件下,MaADH2基因在香蕉幼苗葉片中上調(diào)

7、表達(dá);在低溫脅迫下,MaADH2基因在香蕉幼苗葉片中上調(diào)表達(dá);在干旱脅迫下,輕度干旱誘導(dǎo)了香蕉幼苗根中MaADH2基因的表達(dá),但是隨著干旱程度的增加,MaADH2基因的相對(duì)表達(dá)量降低;在澇害脅迫下,澇害脅迫誘導(dǎo)了MaADH2在根中的表達(dá),且在澇害脅迫24小時(shí)時(shí),MaADH2的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值,而在葉中,MaADH2相對(duì)表達(dá)量變化很小。我們對(duì)正常生長(zhǎng)的香蕉幼苗根和澇害脅迫下的香蕉幼苗根中的MaADH2和MaPDC活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn),在正