甲酸脫氫酶基因的克隆表達及重組菌的高密度培養(yǎng).pdf

1、甲酸脫氫酶屬于D-2-羥基酸脫氫酶類，它可以將甲酸氧化為CO2，同時將NAD+還原為NADH。NAD+依賴型的甲酸脫氫酶(FDH)廣泛存在于自然界中，目前已經(jīng)在多種細菌和真菌中發(fā)現(xiàn)了FDH，甚至在一些哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)了甲酸脫氫酶基因，例如鼠類和人類。 甲酸脫氫酶在工業(yè)生產(chǎn)中有著重要應用，常用于工業(yè)生產(chǎn)中的輔酶再生體系。由于從自然界天然微生物中提取FDH成本比較高，目前對甲酸脫氫酶研究的主要方向集中于采用基因工程方法構(gòu)建重組菌

2、，通過重組菌的高效表達獲得酶。 本文首先利用YPD培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)了含有NAD+依賴型的甲酸脫氫酶基因的博伊丁假絲酵母，提取基因組，并以此基因組為模板進行PCR擴增，得到大小約為1.1kb的基因片段。將此小片段和T載體pMD18-TSimpleVector連接，得到重組質(zhì)粒載體pMD18-T-fdh。雙酶切表達載體pET28a(+)和pMD18-T-fdh，經(jīng)T4DNA連接酶連接得到重組質(zhì)粒pET28a(+)-fdh。將重組

3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主菌EcoliBL21(DE3)中進行表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳驗證蛋白表達。 重組菌構(gòu)建成功后，對重組菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。得到了優(yōu)化培養(yǎng)基：Na2HPO4·7H2O13g/L，NaCl0.5g/L，KH2PO43g/L，NH4Cl3.5g/L，MgSO40.2g/L，葡萄糖10g/L，微量元素2ml/L；培養(yǎng)條件為：搖瓶裝液量30ml/250ml，初始pH值為7.5，接種量為4％；誘導條件為：對數(shù)生長前期