變性高效液相色譜用于乙醇脫氫酶1B和乙醛脫氫酶2的基因分型.pdf

1、背景與目的 乙醇脫氫酶1B(alcoholdehydrogenase-1B)和乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase-2)是乙醇復(fù)雜的代謝通路上兩個(gè)重要的酶。ADH1B基因位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)2帶，ALDH2基因位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)4帶，ADH1B*1基因在第3號(hào)外顯子發(fā)生G143A變異，形成ADH1B*2，ALDH2*1基因在第12號(hào)外顯子發(fā)生G1510A變異，形成ALDH2*2。兩種變異更改了乙醇脫氫

2、酶1B和乙醛脫氫酶2的酶代謝活性，并與亞洲人的酒精依賴性疾病密切相關(guān)。近來，人們還發(fā)現(xiàn)這兩種變異與癌癥，肝臟功能紊亂，冠心病，糖尿病并發(fā)癥，多發(fā)性神經(jīng)病也有一定的聯(lián)系。因此，發(fā)展一種快速高效自動(dòng)化的方法對(duì)兩種基因型進(jìn)行鑒定有助于預(yù)測(cè)個(gè)體酒精相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)以及研究酶變異與酒精相關(guān)疾病的關(guān)系。 目前，檢測(cè)這兩種變異的主要方法有RFLP，PCR-CTPP，SSCP，APLP，MAMA等，這些方法各有其局限性，未在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室得到應(yīng)用。

3、變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)是一種高通量，特異，敏感的檢測(cè)突變和變異的平臺(tái)，我們依據(jù)此平臺(tái)建立了檢測(cè)ADH1B和ALDH2的方法。 設(shè)計(jì)與方法 1.針對(duì)ADH1B和ALDH2基因以及G143A和G1510A變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系。通過DNA測(cè)序獲得ADH1B和ALDH2各種基因型樣品。 2.利用經(jīng)測(cè)序已知的基因型樣品優(yōu)化DHPLC分析雜合子的條件，將PCR產(chǎn)物與特定的已知純合子質(zhì)控PCR產(chǎn)物等體積混合，

4、然后高溫變性后緩慢復(fù)性。運(yùn)用DHPLC對(duì)樣品PCR產(chǎn)物以及混合物在半變性條件下進(jìn)行分析，通過每組峰的形狀的差異對(duì)樣品基因型進(jìn)行區(qū)分，建立檢測(cè)ADH1B和ALDH2基因的PCR-DHPLC技術(shù)。 3.根據(jù)DHPLC的分析結(jié)果，從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進(jìn)行測(cè)序分析，以證實(shí)該方法的準(zhǔn)確性；應(yīng)用方差分析對(duì)三周內(nèi)三個(gè)批次的ADH1B*1/*1和ADH1B*2/*2，ALDH2*1/*1和ALDH2*2/*2純合子的色譜峰保留時(shí)間進(jìn)

5、行對(duì)比，并分析其變異系數(shù)，證實(shí)該方法的穩(wěn)定性；同時(shí)分析廣州地區(qū)隨機(jī)漢族人群的ADH1B和ALDH2的基因頻率和基因型頻率，并應(yīng)用x2檢驗(yàn)該群體樣品是否符合Hardy-Weinberg平衡。 結(jié)果與討論 ADH1B和ALDH2基因的G/G，G/A，A/A三種基因型能夠在DHPLC上進(jìn)行明顯的區(qū)分。 1.用盲法分析對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，用此方法分析廣州地區(qū)150份漢族人基因組DNA樣品，從每組基因型中隨機(jī)選出部分樣品進(jìn)行

6、測(cè)序?qū)φ?，結(jié)果符合率為100％，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性；對(duì)純合子樣品色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，保留時(shí)間變異系數(shù)(CV)的范圍從1.27％到2.71％，證實(shí)了該方法的穩(wěn)定性。 2.該方法分析一個(gè)樣品的兩種基因型只需要30min，成本不足20元，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，極大的提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。 3.x2檢驗(yàn)結(jié)果顯示該所選群體符合Hardy-Weinberg平衡，ADH1B與ALDH2基因頻率與以前所報(bào)道的基本