變性高效液相色譜用于乙醇脫氫酶1B和乙醛脫氫酶2的基因分型.pdf

1、背景與目的 乙醇脫氫酶1B(alcoholdehydrogenase-1B)和乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase-2)是乙醇復雜的代謝通路上兩個重要的酶。ADH1B基因位于4號染色體長臂2區(qū)2帶，ALDH2基因位于12號染色體長臂2區(qū)4帶，ADH1B*1基因在第3號外顯子發(fā)生G143A變異，形成ADH1B*2，ALDH2*1基因在第12號外顯子發(fā)生G1510A變異，形成ALDH2*2。兩種變異更改了乙醇脫氫

2、酶1B和乙醛脫氫酶2的酶代謝活性，并與亞洲人的酒精依賴性疾病密切相關(guān)。近來，人們還發(fā)現(xiàn)這兩種變異與癌癥，肝臟功能紊亂，冠心病，糖尿病并發(fā)癥，多發(fā)性神經(jīng)病也有一定的聯(lián)系。因此，發(fā)展一種快速高效自動化的方法對兩種基因型進行鑒定有助于預測個體酒精相關(guān)疾病的風險以及研究酶變異與酒精相關(guān)疾病的關(guān)系。 目前，檢測這兩種變異的主要方法有RFLP，PCR-CTPP，SSCP，APLP，MAMA等，這些方法各有其局限性，未在大多數(shù)實驗室得到應用。

3、變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)是一種高通量，特異，敏感的檢測突變和變異的平臺，我們依據(jù)此平臺建立了檢測ADH1B和ALDH2的方法。 設(shè)計與方法 1.針對ADH1B和ALDH2基因以及G143A和G1510A變異位點設(shè)計PCR擴增體系。通過DNA測序獲得ADH1B和ALDH2各種基因型樣品。 2.利用經(jīng)測序已知的基因型樣品優(yōu)化DHPLC分析雜合子的條件，將PCR產(chǎn)物與特定的已知純合子質(zhì)控PCR產(chǎn)物等體積混合，

4、然后高溫變性后緩慢復性。運用DHPLC對樣品PCR產(chǎn)物以及混合物在半變性條件下進行分析，通過每組峰的形狀的差異對樣品基因型進行區(qū)分，建立檢測ADH1B和ALDH2基因的PCR-DHPLC技術(shù)。 3.根據(jù)DHPLC的分析結(jié)果，從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進行測序分析，以證實該方法的準確性；應用方差分析對三周內(nèi)三個批次的ADH1B*1/*1和ADH1B*2/*2，ALDH2*1/*1和ALDH2*2/*2純合子的色譜峰保留時間進

5、行對比，并分析其變異系數(shù)，證實該方法的穩(wěn)定性；同時分析廣州地區(qū)隨機漢族人群的ADH1B和ALDH2的基因頻率和基因型頻率，并應用x2檢驗該群體樣品是否符合Hardy-Weinberg平衡。 結(jié)果與討論 ADH1B和ALDH2基因的G/G，G/A，A/A三種基因型能夠在DHPLC上進行明顯的區(qū)分。 1.用盲法分析對該方法進行評價，用此方法分析廣州地區(qū)150份漢族人基因組DNA樣品，從每組基因型中隨機選出部分樣品進行

6、測序?qū)φ?，結(jié)果符合率為100％，證實了該方法的準確性；對純合子樣品色譜峰的保留時間進行統(tǒng)計學分析，保留時間變異系數(shù)(CV)的范圍從1.27％到2.71％，證實了該方法的穩(wěn)定性。 2.該方法分析一個樣品的兩種基因型只需要30min，成本不足20元，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，極大的提高了檢測效率，降低了檢測成本。 3.x2檢驗結(jié)果顯示該所選群體符合Hardy-Weinberg平衡，ADH1B與ALDH2基因頻率與以前所報道的基本