葡萄糖脫氫酶基因表達及吡咯喹啉醌生物合成.pdf

1、葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH)包括NADP+依賴的葡萄糖脫氫酶和醌蛋白葡萄糖脫氫酶。作為磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，NADP+依賴的葡萄糖脫氫酶在食品醫(yī)藥領域發(fā)揮重要作用。醌蛋白葡萄糖脫氫酶以吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)為輔酶，作為新型輔因子在醫(yī)藥等方面而引起關(guān)注。葡萄糖脫氫酶的生物學功能研究雖有一段歷史，但需完善，同時吡咯喹啉喹的產(chǎn)量還處于很低水平，本課題針對目前

2、存在的問題做了深入研究，旨在研究葡萄糖脫氫酶的生物學功能及提高吡咯喹啉醌的發(fā)酵產(chǎn)量:
　　1、對來源于肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌中的NADP+依賴的葡萄糖脫氫酶的基因序列進行比對并構(gòu)建工程菌，通過測定三株工程菌生物量、葡萄糖剩余量以及酶活，發(fā)現(xiàn)相比帶有空質(zhì)粒的菌株，三株工程菌的生物量顯著提高，葡萄糖剩余量明顯減少，酶活性分別提高為8.5倍、10.5倍和12倍，表明葡萄糖脫氫酶的超表達可以促進菌體生長。
　　2、PCR擴增來源于

3、大腸桿菌中的醌蛋白葡萄糖脫氫酶基因，構(gòu)建重組載體后導入到肺炎克雷伯氏菌中。隨后通過高效液相色譜法探索PQQ檢測條件，確定波長為200 nm，流速為0.8 mL/min，并確定流動相中甲醇與水（加入5‰磷酸）的泵比例為10∶90，繪制PQQ標準曲線，R2為0.999，并對構(gòu)建的工程菌中PQQ含量進行檢測。
　　3、以PQQ的合成前體物谷氨酸和酪氨酸為切入點，分別進行單因素水平和四因素三水平正交實驗做發(fā)酵條件優(yōu)化。單因素實驗中分別添加