基因工程外文翻譯--由共表達(dá)碳酰還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化（譯文）

1、中文 中文 3800 字文獻(xiàn)出處： 文獻(xiàn)出處：Kizaki N, Yasohara Y, Hasegawa J, et al. Synthesis of optically pure ethyl ( S )-4-chloro-3-hydroxybutanoate by, Escherichia coli, transformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose

2、 dehydrogenase genes[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2001, 55(5):590.由共表達(dá)碳酰 碳酰還原酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞合成純光學(xué)（ 合成純光學(xué)（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯Kizaki N, Yasohara Y, Hasegawa J, et al.1.摘要 摘要本本篇文獻(xiàn)研究了利用 COBE 不對(duì)稱合成（S）-4-氯-3-羥基丁

3、酸乙酯（CHBE） 。大腸桿菌細(xì)胞作為催化劑同時(shí)表達(dá)了來自念珠菌屬辛夷的碳酰還原酶和來自巨大芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因。在水/有機(jī)溶劑兩相體系中，(S)-CHBE 在有機(jī)相中的濃度可以達(dá)到2.58M（430g/l） ，摩爾產(chǎn)率達(dá)到 85%。大腸桿菌的副產(chǎn)物 S1 和 GDH 也達(dá)到了 1.25M（208g/l） ，COBE 在水相中不穩(wěn)定，所以(S)-CHBE 可以在水單相中不停的生成。在這種情況下，適當(dāng)?shù)膹?NADP++到 CHBE

4、的轉(zhuǎn)變達(dá)到了 21,600 mol/mol。所形成的 CHBE 的旋光度在這種體系中 100%對(duì)映體過量。在水相中用攜帶含有 S1 和 GDH 基因質(zhì)粒的 E. coli HB101 作為催化劑不對(duì)稱還原是比較簡(jiǎn)單的。并且，這種體系并不額外需要商業(yè) GDH 或者有機(jī)溶劑。因此，這種體系對(duì)于實(shí)際合成純光學(xué)活性的(S)-CHBE 是非常方便的。介紹具有旋光性的（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯在藥物制劑的合成中是重要的手性化合物。其右旋體是

5、 L-卡尼汀的前體，其左旋體是羥甲基戊二酰輔酶 A 還原酶抑制劑的起始材料。許多研究描述了以面包酵母為基礎(chǔ)微生物或者酶的 COBE 的不對(duì)稱還原。我們先前已經(jīng)知道利用來自念珠菌屬辛夷 AKU4643 細(xì)胞催化 COBE 生成光學(xué)純度 96%的 CHBE。這種酵母至少有三種立體選擇性的還原酶，這種酵母產(chǎn)生的 CHBE 并非純光學(xué)的，在這三種酶之中，NADPH-依賴碳酰還原酶，我們克隆并測(cè)序編碼 S1 的基因，并在大腸桿菌中過表達(dá)。大腸桿菌

6、轉(zhuǎn)化細(xì)胞在葡萄糖，NADP+和商業(yè)化的葡萄糖脫氫酶作為輔酶因子的啟動(dòng)子催化COBE 生成純光學(xué)的 CHBE。我們構(gòu)建這三種大腸桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞共表達(dá)來自的 S1 和來自巨大芽孢桿菌的 GDH，并插入到 pSTV28 質(zhì)粒的 EcoRI-PstI 的酶切位點(diǎn)。pSTVG 質(zhì)粒被導(dǎo)入到 E. coli HB101。2.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基和培菌 和培菌2*YT 培養(yǎng)基 包含有 1.6%細(xì)菌用胰蛋白胨，1.0%酵母提取物，0.5% NaCl，pH7

7、.0.攜帶有 pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1 的大腸桿菌 HB101 被接種到有 0.1mg/ml 氨芐青霉素的 2ml 的 2*YT 培養(yǎng)基，37°C 搖床 15 小時(shí)。將 0.5ml 菌液接種到 100ml2*YT 培養(yǎng)基的 500ml 燒瓶中。在 37°C 搖床培養(yǎng) 13 小時(shí)。攜帶有 pNTS1 和 pSTVG 質(zhì)粒的大腸桿菌 HB101 在 2*YT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)方法相似，只是培養(yǎng)

8、基中要加入 0.1 mg/ml 的氨芐青霉素和 0.1 mg/ml 的氯霉素。2.3 無細(xì)胞 無細(xì)胞抽提 抽提液和酶鑒定 液和酶鑒定將 100ml 培養(yǎng)液離心收獲菌體，用 50ml0.1mol/LpH 為 6.5 的磷酸緩沖液懸浮，然后超聲粉碎。細(xì)胞碎片通過離心可以去除，收集上層清液就是無細(xì)胞抽提物。碳酰還原酶 S1的活性由分光光度計(jì)測(cè)量如下：測(cè)定的混合物包括：0.1mol/LpH6.5 的磷酸二氫鉀緩沖液，0.1mMNADPH 和 1

9、mMCOBE。反應(yīng)在 30°C 條件下反應(yīng)，并且隨時(shí)監(jiān)測(cè)其在 340nm 處的吸光值。測(cè) GDH 混合物包括：1M pH 8.0 的 Tris-HCl 的緩沖液，100mM 的葡萄糖，2mM 的NADP+。反應(yīng)在 25°C 下進(jìn)行，監(jiān)測(cè)其在 340nm 處的吸光值。一個(gè)單位 S1 或 GDH 被定義為每分鐘催化還原 1μmol NADP+或氧化 1 μmol NADPH 的量。蛋白質(zhì)的測(cè)定通過含有考馬斯亮藍(lán)的蛋白質(zhì)測(cè)

10、定試劑利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。2.4 酶穩(wěn)定性的研究 酶穩(wěn)定性的研究一毫升含有含有 pNTS1 質(zhì)粒的 E. coli HB101 的無細(xì)胞抽提液的 100mM 磷酸氫二鉀緩沖液（pH6.5）與等體積的有機(jī)溶劑混合?；旌衔镌?30 °C 震搖 48 小時(shí)后，水相中殘留的酶活力即是上述的酶活力。2.5 表達(dá) 表達(dá) S1 基因和 基因和 GDH 基因的大腸桿菌細(xì)胞在兩相反應(yīng)體系中的 基因的大腸桿菌細(xì)胞在兩相反應(yīng)體系中的還