葡萄糖氧化酶基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、葡萄糖氧化酶是重要的工業(yè)酶制劑之一，因為其專一性和高效性的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，尤其是應(yīng)用于生產(chǎn)葡萄糖酸等系列產(chǎn)品，如葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鈣等，每年的全球需求量約為40-50萬噸。另外，由于葡萄糖氧化酶作用于葡萄糖的反應(yīng)消耗氧氣，也常被用于食品保鮮，因為作用于葡萄糖的專一性，也常應(yīng)用到檢測血糖。
　　用于葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)的微生物菌種主要是黑曲霉和畢赤酵母兩種，黑曲霉是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的安全可靠的工業(yè)微生物菌種，主要用

2、于生產(chǎn)檸檬酸等有機酸和淀粉酶等酶制劑產(chǎn)品。畢赤酵母是常用的表達(dá)外源蛋白的宿主，已經(jīng)成功實現(xiàn)了多種外源蛋白的表達(dá)。
　　本論文的研究內(nèi)容分為兩個方面，一方面是通過基因工程的辦法改造葡萄糖氧化酶的產(chǎn)生菌黑曲霉，另一方面是構(gòu)建畢赤酵母的基因工程菌來生產(chǎn)葡萄糖氧化酶。
　　通過基因工程的辦法改造葡萄糖氧化酶的產(chǎn)生菌黑曲霉，進(jìn)行兩種研究方法的嘗試，包括使用自我復(fù)制的游離質(zhì)粒和整合表達(dá)兩種方式。正確地連接葡萄糖氧化酶基因GOD、糖化酶的

3、啟動子信號肽序列GlaPS和終止子序列GlaT到自我復(fù)制的質(zhì)粒PTRII中，實現(xiàn)了游離質(zhì)粒表達(dá)載體PTRII-GOD-GlaPS-GlaT的成功構(gòu)建。通過黑曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式，成功實現(xiàn)了黑曲霉的轉(zhuǎn)化。經(jīng)菌絲體的裂解和巢式PCR的方式，篩選到了游離質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株。搖瓶發(fā)酵的結(jié)果顯示酶活力提高50％-69％。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵條件優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)劑為淀粉，培養(yǎng)基中玉米淀粉的添加量為1％，葡萄糖的添加量為15％時，發(fā)酵效果最好，且隨著接種

4、量的適量增加，酶活力進(jìn)一步提高。整合表達(dá)方面，要把葡萄糖氧化酶基因整合到染色體上，借助單交換的方式整合，成功構(gòu)建單交換的表達(dá)載體MpAN7-1-GlaPSGOD和MpAN7-1-GlaPSGOD-5UTR。雙交換整合表達(dá)方面，把葡萄糖氧化酶基因整合到染色體上，替換糖化酶基因的位置，借助糖化酶基因的表達(dá)環(huán)境來表達(dá)葡萄糖氧化酶基因，成功構(gòu)建雙交換的表達(dá)載體pUC19-3UTR-gpdAHPH-GOD-5UTR，搭建了黑曲霉基因工程改造的平臺