產尿毒素分解酶基因工程菌的構建.pdf

1、第一章產尿酸氧化酶基因工程菌的構建 目的： 將尿酸氧化酶基因克隆到乳酸桿菌中，使之能產生尿酸氧化酶，為一菌多基因克隆打下基礎。 方法： 從產朊假絲酵母菌中提取基因組DNA，根據(jù)genbank上已知的該菌尿酸氧化酶基因序列，設計引物PCR擴增尿酸氧化酶基因片段，將其克隆入質粒pMG36e，構建成重組質粒PMG36e-U，并轉化大腸桿菌DH5 α，篩選鑒定，提取重組質粒PMG36e-U，把重組質粒電穿孔轉化保

2、加利亞乳酸桿菌， SDS-PAGE鑒定基因工程菌體裂解液中的尿酸氧化酶，并測定尿酸氧化酶的活性。 結果： 1．從產朊假絲酵母基因組中擴增到的尿酸氧化酶基因片段長度為0.9kb。 2．構建的含重組質粒pMD18-T-U的大腸桿菌，用Xha Ⅰ和HindⅢ雙酶切及菌落PCR鑒定，并測序鑒定，基因片段序列與genebank上尿酸氧化酶基因序列完全一致。 3．用含2.5μg/mL的紅霉素MRS培養(yǎng)基篩選到用重組質

3、粒pMG36e-U成功轉化的重組保加利亞乳酸桿菌。 4．重組保加利亞乳酸桿菌經不連續(xù)SDS-PAGE分析，表達重組蛋白的分子量約為34KD，與從尿酸氧化酶基因序列推測的303個氨基酸的理論分子量相符。 5．在體外測定用DEAE DE52纖維柱純化后的重組保加利亞乳酸桿菌酶液，酶活性可達0.39 μ/mL，較原始菌株稍低。 結論： 尿酸氧化酶基因克隆入保加利亞乳酸桿菌中，并具有酶分解能力。 第二章產

4、肌酐水解酶基因工程菌的構建 目的： 將肌酐水解酶基因克隆到保加利亞乳酸桿菌中，使之能產生肌酐水解酶，為一菌多基因克隆打下基礎。 方法： 從惡臭假單胞菌中提取基因組DNA，根據(jù)genbank上已知的惡臭假單胞菌肌酐水解酶基因序列，設計引物PCR擴增肌酐水解酶基因片段，將其克隆入質粒pMG36e，構建成重組質粒PMG36e-C，并轉化大腸桿菌DH5a，篩選鑒定，提取重組質粒PMG36e-C，把重組質粒電穿孔轉

5、化保加利亞乳酸桿菌， SDS-PAGE鑒定基因工程菌體裂解液中的肌酐水解酶，并測定肌酐水解酶的活性。 結果： 1．從惡臭假單胞菌基因組中擴增到的肌酐水解酶基因片段在小為0.78kb。 2．構建的含重組質粒pMD18-T-C的大腸桿菌，用Xha Ⅰ和HindⅢ雙酶切及菌落PCR鑒定，并測序鑒定，基因片段序列與genebank上肌酐水解酶基因序列完全一致。 3．用含2.5μg/mL的紅霉素MRS培養(yǎng)基篩選到重