α-乙酰乳酸脫羧酶基因工程菌株構(gòu)建及產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、雙乙酰是啤酒中的重要風味物質(zhì)，但含量過高會影響啤酒的品質(zhì)。雙乙酰的口味閾值很低，僅為0.1～0.15mg/L，超過此閾值會給啤酒帶來不愉快的餿飯味，所以傳統(tǒng)的啤酒釀造需要一個很長的低溫貯藏期來降低雙乙酰的含量。 α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate decarboxylase，α-ALDC,EC.4.1.1.5)，它能將啤酒生產(chǎn)過程中雙乙酰的前驅(qū)物質(zhì)α-乙酰乳酸迅速地分解為乙偶姻，從而快速地降低啤酒中雙乙酰的含量，促

2、進啤酒的成熟并縮短發(fā)酵周期，從而提高了設(shè)備的利用率及降低生產(chǎn)成本。 本文構(gòu)建了低雙乙酰產(chǎn)量的酵母基因工程菌株。首先通過PCR的方法，根據(jù)GenBank中登陸的ALDC基因序列(L04470)設(shè)計了5'端引物和3'端引物，以枯草芽孢桿菌菌體為模板克隆到了ALDC基因，全長780bp，與GenBank中登陸的序列進行比對，達到93.6％的同源性。然后將獲得的基因連接到表達質(zhì)粒載體pYC6/CT上，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組表達載體pYC

3、6/CT-ALDC轉(zhuǎn)化進入酵母HDY-01中，利用pYC6/CT上帶有的Blasticidin抗性基因來篩選轉(zhuǎn)化子，進而對轉(zhuǎn)化子的酶蛋白進行活性檢測，從而在諸多轉(zhuǎn)化子中篩選到基因得以穩(wěn)定表達的重組子，選擇酶活性較高的一株進行α-乙酰乳酸脫羧酶產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及發(fā)酵參數(shù)的檢測，結(jié)果表明：在諸多轉(zhuǎn)化子中1-27菌株酶活性最高，達到0.0081U/mL，對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化表明，在36h、30℃、10％接種量條件下酶活較高，達到0.0087U/m