球孢白僵菌基因工程菌株構建及殺蟲效率評價.pdf

1、隨著社會經濟的發(fā)展和人們環(huán)保意識的提高,環(huán)境友好型生物源殺蟲劑的應用受到越來越高的重視。利用昆蟲病原真菌加工而成的真菌殺蟲劑的應用及基礎研究得到了長足的發(fā)展,但由于存在擊倒昆蟲時間較長、對環(huán)境條件要求高等缺點,真菌殺蟲劑的廣泛應用受到限制。因此利用基因工程和細胞工程等技術提高菌株毒力,遺傳改造獲得適合市場需要的真菌殺蟲劑具有重要的應用價值。球孢白僵菌作為重要的昆蟲病原真菌在害蟲的生物防治中發(fā)揮著重要作用。本文以球孢白僵菌作為出發(fā)菌株,同

2、時引入雙價毒力基因,即降解昆蟲體壁的類枯草桿菌蛋白酶基因Pr1A和北非蝎昆蟲特異性神經毒素多肽基因AaIT,構建了高毒力雙價工程菌株。 本研究首先構建了含有不同篩選標記和目的基因的載體pGPS3Ben-Pr1A和pGPET1。并且通過對分生孢子的抑制性實驗,篩選出兩種抗性藥對球孢白僵菌的最佳抑制濃度,其中草胺磷對球孢白僵菌的最佳抑制濃度為100μg/ml,苯菌靈對球孢白僵菌的最佳抑制濃度為2μg/ml。本實驗選用了兩種不同的遺傳

3、轉化方法對球孢白僵菌進行遺傳改造,獲得了一價工程菌株Bb13T和Bb202T,及二價工程菌株Bb13Tpr1A。RT-PCR和Western blot結果證明,Pr1A和AaIT均在重組菌株中組成性轉錄和表達。PR1A蛋白酶活性測定結果表明,超表達PR1A的二價工程菌株的酶活相對于野生型菌株得到了極大的提高。并且通過初步的注射蟲體實驗,篩選出毒力相對較高的一價工程菌株Bb13T-4-1、Bb13T-10-3和Bb202T-7,和二價工程

4、菌株Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2和Bb13TPr1A-3。對松墨天牛的生物測定結果表明,超量表達AAIT的一價工程菌株Bb202T-7提高了殺蟲效率約11.1％。使用大蠟螟(Galleria mellonella)和馬尾松毛蟲進行生物測定的結果同樣顯示,超量表達AaIT單價基因及AaIT和pr1A雙價基因均能顯著地提高重組菌株的毒力。用大蠟螟做生測試蟲,在孢子濃度為1×107個/ml時,與野生型菌株Bb13相比,超量表

5、達AaIT的重組菌株Bb13T的致死中時(LT50)平均縮短了24.4％,同時超量表達AaIT和pr1A雙價基因的Bb13TPr1A的LT50平均縮短了20.9％。馬尾松毛蟲的生物測定中,在孢子濃度為1×107個/ml時,與野生型菌株Bb13相比,超量表達AaIT基因的重組菌株Bb13T的LT50平均縮短了40％,其致死中濃度(LC50)降低了約15倍的劑量；超量表達AaIT和Pr1A雙價基因的Bb13Tpr1A的LT50平均縮短了36