球孢白僵菌四個Septin基因的功能解析與無外源抗性標記表達殺蟲蛋白Vip3Aa1的工程菌構建.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是重要的昆蟲病原真菌，目前廣泛應用于農林害蟲的生物防治。其制劑的有效成份為活體分生孢子，田間殺蟲效果的穩(wěn)定性及持效性受作物環(huán)境或季節(jié)性因素的制約，如環(huán)境溫度、紫外線輻射、化學農藥等。因此，研究發(fā)掘球孢白僵菌生長發(fā)育及抗逆性狀的調控基因服務于菌株的遺傳改良，具有重要的現(xiàn)實意義。同時，通過基因工程技術在提高生防真菌生防潛能的同時盡可能降低環(huán)境安全性風險，是需要探索的重要技術難題。因此，本論文

2、開展了兩方面的研究工作，一是研究解析了球孢白僵菌Septin基因家族的基本生物學功能，二是探索了利用內源乳清酸核苷5一磷酸脫羧酶基因ura3作為營養(yǎng)缺陷型安全性標記，在球孢白僵菌中表達昆蟲中腸特異性胃毒蛋白Vip3Aa1而構建低風險工程菌株的可能性。
　　球孢白僵菌Septin基因家族的功能解析 Septin是在進化上高度保守的一類GTP結合蛋白，在結構上與Ras GTP激酶家族的成員相似。在球孢白僵菌中存在4個Septin蛋白(

3、BspA/B/C/D)，與12種代表性絲狀真菌中對應蛋白的同源性達到79％以上。Septin基因的缺失在不同程度上影響球孢白僵菌的萌發(fā)、生長及分生孢子形成。敲除株的分生孢子萌發(fā)提速，但菌絲細胞隔膜形成滯后且數(shù)量減少，以致生長受到抑制，尤在果糖作為唯一碳源的基礎培養(yǎng)基上表現(xiàn)較嚴重的生長缺陷。在標準培養(yǎng)基上正常培養(yǎng)期間，分生孢子產量在敲除株△bspA中下降80～89％，在△bspB中下降49～67％，在△bspC中下降60～76％，在△bs

4、pD中下降10～39％。在脅迫應答測定中，敲除株在生長期間對胞壁干擾劑剛果紅的敏感性升高，而對強氧化劑及高滲劑的敏感性則有所降低。其分生孢子耐高溫和紫外輻射能力也有所變化。其中，△bspA耐高溫、耐紫外輻射能力均有所下降，△bspD僅表現(xiàn)耐紫外輻射的能力下降，而△bspB耐高溫能力增強，△bspC耐紫外輻射能力提高。但是，敲除株對大蠟螟幼蟲的毒力與野生株和回補株相比未見有實質性的變化。結果表明，4個septin蛋白不僅是球孢白僵菌萌發(fā)生

5、長、細胞分隔、產孢的重要調控因子，還參與多脅迫應答反應的調控，但與毒力無顯著關聯(lián)。
　　利用內源安全標記基因構建無外源抗性標記的球孢白僵菌工程菌株乳清酸核苷5一磷酸脫羧酶在細胞內可催化尿苷（尿嘧啶）的合成，參與基因的翻譯而影響細胞生長。其基因ura3缺失致使細胞自身不能有效合成尿苷或尿嘧啶，因而無法正常生長，但加入外源尿苷即可恢復生長。利用這一特性，以球孢白僵菌ura3作為營養(yǎng)缺陷型標記取代原有的抗除草劑基因草丁膦抗性基因bar，