球孢白僵菌組氨酸激酶家族、核激酶Wee1和磷酸化酶Cdc25的功能解析.pdf

1、球孢白僵菌是被廣泛應(yīng)用于害蟲生物防治的昆蟲病原真菌的典型代表，其制劑的活性成份一般是具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分生孢子。因此，生防菌劑的田間殺蟲效果和穩(wěn)定性不僅取決于生產(chǎn)菌株對(duì)靶標(biāo)害蟲的毒力，還在很大程度上取決于細(xì)胞對(duì)高溫、陽(yáng)光紫外輻射及農(nóng)用化合物等環(huán)境脅迫的抵抗力。此外，菌株的工藝性狀如生長(zhǎng)和產(chǎn)孢水平關(guān)系到菌劑的生產(chǎn)難易程度和成本。圍繞這些構(gòu)成生防潛能的因素，解析了球孢白僵菌組氨酸激酶家族的結(jié)構(gòu)及功能，發(fā)現(xiàn)八種組氨酸激酶都是有生物學(xué)意義，參與

2、生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性狀及毒力的差異調(diào)節(jié)，重點(diǎn)揭示了組氨酸激酶Ⅷ通過(guò)對(duì)光周期和紅光及紅外光的反應(yīng)調(diào)控分生孢子產(chǎn)量的重要作用。繼而研究揭示了核激酶Wee1和磷酸化酶Cdc25通過(guò)調(diào)節(jié)Cdk1的磷酸化水平參與調(diào)控球孢白僵菌的細(xì)胞周期、細(xì)胞大小及毒力等生物學(xué)性狀。主要研究結(jié)果概述如下:
　　球孢白僵菌組氨酸澈酶家族的功能絲狀真菌組氨酸激酶(HK)可分為11個(gè)組別，組別數(shù)和各組別的成員數(shù)在菌種間差異較大，但大多數(shù)組別的功能未知，被認(rèn)為可能是進(jìn)化

3、過(guò)程的冗余。通過(guò)基因組分析，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌有八個(gè)組別的組氨酸激酶且每組僅有一個(gè)成員。通過(guò)構(gòu)建單基因敲除和回補(bǔ)菌株并進(jìn)行多表型分析，證明所有HK都是有功能的，生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、侵染和多脅迫應(yīng)答反應(yīng)等若干性狀中至少一個(gè)性狀因單一基因的缺失而受到顯著影響。其中，△HK3喪失94％的產(chǎn)孢能力，對(duì)氧化、胞壁穩(wěn)定干擾、高溫及UV-B紫外脅迫的敏感性升高，經(jīng)體壁和血腔侵染的能力下降，還獲得了對(duì)撲海因殺菌劑的抗性?！鱄K8菌落生長(zhǎng)異常，對(duì)高滲、高溫及UV-B

4、脅迫的敏感性下降，但對(duì)氧化脅迫的抗性增強(qiáng)?！鱄K6的毒力和耐高溫能力下降，而△HK10的體壁侵染力及對(duì)胞壁干擾劑SDS的敏感性增強(qiáng)，二者都更抗氧化和UV-B脅迫。△HK9對(duì)氧化、胞壁穩(wěn)定干擾、高溫和UV-B等多種脅迫都更敏感且經(jīng)血腔侵染的毒力下降。除此之外，△HK2、△HK5和△HK11在應(yīng)答SDS或UV-B脅迫反應(yīng)及毒力方面發(fā)生1～3種表型變化。有趣的是，在高滲、氧化或撲海因脅迫條件下，△HK3和△HKK高滲甘油(HOG)信號(hào)通路中的

5、Hog1磷酸化水平或胞壁完整性(CWI)信號(hào)通路中的Slt2磷酸化水平發(fā)生顯著變化，說(shuō)明HK3和HK8可能在HOG或CWI信號(hào)通路中扮演某種角色，因而參與調(diào)控多種表型。結(jié)果顯示，所有八個(gè)組別的HK在球孢白僵菌中都不是進(jìn)化冗余的，盡管功能上相互間差異較大，它們?cè)谠摼鷮?duì)昆蟲寄主及其復(fù)雜多樣環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　球孢白僵菌光敏蛋白Bbphy(HK8)對(duì)光周期與不同光波的反應(yīng)及對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的調(diào)控作用絲狀真菌的HK8又稱光敏蛋

6、白(phytochrome，Phy)，除具有組氨酸激酶的所有結(jié)構(gòu)特征之外，其N端含有一個(gè)能感受紅光及紅外光的光感受元件，對(duì)真菌發(fā)育具有重要意義。球孢白僵菌HK8即Bbphy具有同樣的光感受元件，由于其基因的缺失導(dǎo)致嚴(yán)重產(chǎn)孢缺陷，繼而對(duì)其可能的機(jī)理進(jìn)行了探索。在25℃和3:21～24:0h（光照∶黑暗時(shí)數(shù)）光周期條件下，△Bbphy在富營(yíng)養(yǎng)條件下的菌落生長(zhǎng)顯著慢于野生株，在貧脊?fàn)I養(yǎng)條件下的菌落生長(zhǎng)顯著快于野生株，且變化幅度不受光周期的影響

7、，但在12:12h條件下對(duì)不同碳源或氮源的利用效率或耐受碳、氮饑餓的能力呈現(xiàn)差異。在富營(yíng)養(yǎng)平板上，△Bbphy的分生孢子產(chǎn)量在0:24～16:8h光周期范圍內(nèi)隨日光照時(shí)數(shù)遞增，模型擬合的增速為3.4×107個(gè)孢子/h光照。野生菌株與回補(bǔ)菌株的產(chǎn)孢量在金黑暗條件下也大幅下降，且降幅遠(yuǎn)小于△Bbphy，但只要日光照達(dá)到3h即恢復(fù)到正常水平，因而不存在隨日光照時(shí)數(shù)遞增的現(xiàn)象。在全天光照條件下，紅光(660μm)和紅外光(760μm)都顯著降低

8、△Bbphy的產(chǎn)孢量，但藍(lán)光(450μm)和白光則不影響其產(chǎn)孢量。此外，△Bbphy的產(chǎn)孢量在紅光和紅外光的長(zhǎng)日照(16:8h)和短日照(3:21 h)條件下都顯著下降。不同光波和光周期條件下7個(gè)產(chǎn)孢相關(guān)基因在△Bbphy中轉(zhuǎn)錄水平的變化與其上述條件下產(chǎn)孢量的變化基本吻合。結(jié)果顯示，Bbphy通過(guò)感受光周期變化與紅光及紅外光而調(diào)控球孢白僵菌的無(wú)性發(fā)育即分生孢子形成。
　　球孢白僵菌核激酶Wee1和磷酸化酶Cdc25的功能分析病原真

9、菌細(xì)胞周期調(diào)控是其侵染宿主和適應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵。在球孢白僵菌中，調(diào)控細(xì)胞周期必須的Cdk1激酶的活性被證明是受核激酶Wee1和磷酸化酶Cdc25調(diào)控的，因?yàn)镃dk1的磷酸化信號(hào)在△wee1減弱，在△cdc25增強(qiáng)，而在雙敲除菌株△wee1△cdc2中基本檢測(cè)不到。因此，這些單基因和雙基因的敲除株在細(xì)胞周期、菌絲分隔方式及形態(tài)以及影響隔膜形成的若干效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平方面都發(fā)生了不同方向的改變。△wee1的菡絲細(xì)胞變短，△cdc25的菌絲細(xì)胞細(xì)

10、長(zhǎng)，而△wee1△cdc25的菌絲細(xì)胞既粗短又腫大。產(chǎn)孢缺陷以△wee1最嚴(yán)重，其次為△cdc25。此外，突變菌株的分生孢子和芽生孢子在細(xì)胞大小和復(fù)雜度上也發(fā)生了不同的變化，其中△wee1和△wee1△cdc25的分生孢子萌發(fā)的芽管異常分支。分生孢子耐高溫和UV-B輻射的能力在△wee1△cdc25中下降最多，在△wee1中次之，而在△cdc5中卻顯著增強(qiáng)。雙基因敲除和磷酸位點(diǎn)突變Cdk1T14A/P15F的菌株在毒力上受損最嚴(yán)重，其次