重組大腸桿菌高效生產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶和L-色氨酸的研究.pdf

1、嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷補(bǔ)救代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在抗腫瘤基因治療、核苷類藥物合成等方面具有廣泛的應(yīng)用。L-色氨酸是人體八種必需氨基酸之一，在醫(yī)藥、食品添加劑、飼料等方面具有重要的市場(chǎng)發(fā)展前景.
　　 本文開(kāi)展了在重組大腸桿菌中如何實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶和L-色氨酸的系統(tǒng)研究。
　　 首先構(gòu)建了高效表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶基因的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)宿主細(xì)胞中，構(gòu)建了能夠表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶的重組

2、大腸桿菌。通過(guò)優(yōu)化重組細(xì)胞的表達(dá)和誘導(dǎo)條件，實(shí)現(xiàn)了嘌呤核苷磷酸化酶的高效可溶性表達(dá)，最高表達(dá)水平達(dá)到196U/mL。進(jìn)一步研究了重組酶的底物特異性，發(fā)現(xiàn)與非重組嘌呤核苷磷酸化酶的特性基本一致，并發(fā)現(xiàn)瓊脂是一種較合適的固定化載體，開(kāi)展了游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的酶學(xué)特性比較、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明，細(xì)胞的固定化降低了重組細(xì)胞對(duì)底物的親和力和催化效率，卻顯著提高其穩(wěn)定性和反復(fù)使用性。固定化細(xì)胞催化的反應(yīng)在較低底物濃度下由于擴(kuò)散限制偏離

3、了米氏方程規(guī)律，但在高濃度條件下依然遵守米氏方程規(guī)律，而游離細(xì)胞催化的反應(yīng)均完全遵從米氏方程。以合成利巴韋林為例，開(kāi)展了固定化重組細(xì)胞催化合成核苷類藥物的研究．通過(guò)優(yōu)化游離細(xì)胞合成利巴韋林的多個(gè)反應(yīng)條件，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了80.8％．當(dāng)采用固定化細(xì)胞合成利巴韋林時(shí)，在添加18.8g/L固定化細(xì)胞的條件下，經(jīng)過(guò)4小時(shí)反應(yīng)，利巴韋林的轉(zhuǎn)化率盡管有所下降(70.2%)，但可以反復(fù)使用，經(jīng)過(guò)連續(xù)10次反應(yīng)，利巴韋林的轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯降低。<

4、br>　　 其次開(kāi)展了重組大腸桿菌高產(chǎn)L-色氨酸的發(fā)酵工程研究?；跇?gòu)建的大腸桿菌代謝工程菌，首先優(yōu)化了種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基及多種發(fā)酵條件。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)展了間歇和流加發(fā)酵研究，結(jié)果表明，在間歇發(fā)酵條件下磷酸鹽添加對(duì)L-色氨酸發(fā)酵影響較大，確定了流加發(fā)酵時(shí)磷酸鹽的添加量以20g/L為最佳．葡萄糖指數(shù)流加方式能夠明顯提高發(fā)酵產(chǎn)率，最大的產(chǎn)物濃度和發(fā)酵產(chǎn)率分別達(dá)到10.6g/L和0.45g/(L·h)。進(jìn)一步采用底物反饋流加方式能夠維持

5、發(fā)酵液中較低的葡萄糖濃度，L-色氨酸的產(chǎn)量提高到25.5g/L。最后提出了一種新型的指數(shù)流加策略，L-色氨酸產(chǎn)量和平均產(chǎn)率分別提高到24.9g/L和0.58g/(L·h)的較高水平。
　　 隨后系統(tǒng)考察了各種添加劑對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響，結(jié)果表明非離子型表面活性劑能有效促進(jìn)L-色氨酸累積，而抗生素和陽(yáng)離子表面活性劑效果不明顯。分別添加吐溫60和聚醚L61進(jìn)行間歇和流加發(fā)酵，L-色氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到了32.3和35.5g/L．進(jìn)一步

6、采用代謝工程技術(shù)，通過(guò)估算L-色氨酸生物合成途徑的代謝流量分布，發(fā)現(xiàn)吐溫60和聚醚L61引起了流量分布的明顯變化，導(dǎo)致L-色氨酸合成流量的顯著增加．開(kāi)發(fā)了一條從發(fā)酵液中分離純化L-色氨酸的工藝路線。研究了強(qiáng)酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附分離L-色氨酸的單元操作，建立了L-色氨酸吸附等溫線模型及吸附動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)分析，形成了高效的柱層析分離純化工藝。在此吸附分離工藝條件下，并結(jié)合其他分離操作的優(yōu)化，L-色氨酸總收率達(dá)到68.8%，產(chǎn)品純度達(dá)到97.5