利用重組大腸桿菌高效合成S-腺苷蛋氨酸的研究.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)，又名孓腺苷甲硫氨酸，在生物體內(nèi)廣泛存在，它的重要性僅次于ATP，是一種重要的生理活性物質(zhì)，具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基、轉(zhuǎn)氨丙基等作用，與核酸、蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)以及維生素的合成緊密相關(guān)，并且它對肝病、抑郁癥和關(guān)節(jié)炎等疾病有明顯的治療效果。
　　目前，SAM價格高昂且不能被廣泛用于臨床的原因，主要是因為其活力不足且不穩(wěn)定，且只有(S，S)-SAM，也就是(-)-

2、SAM才具有生物活性。SAM在我國的研究開發(fā)較晚，肝病和關(guān)節(jié)炎患者的市場需求又十分巨大。因此，利用合適的制備方法來提高SAM的產(chǎn)量，使其可以得到工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的意義非常大。
　　化學合成法、酶促轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法這三種方法是SAM的主要生產(chǎn)方法?；瘜W合成法產(chǎn)率低下，且底物又十分昂貴，況且從產(chǎn)物中分離出有活性的SAM比較困難，所以不用這類方法。酶促轉(zhuǎn)化法在一定程度上提高了SAM合成酶的酶活，而且產(chǎn)物的無污染和純度高等特點，體現(xiàn)了它的優(yōu)

3、勢，但SAM合成酶在體內(nèi)濃度較低，不易提取，而且ATP的成本高昂，這成為一大限制因素。近年來，以酵母為主的發(fā)酵法應用廣泛，但是以大腸桿菌為表達系統(tǒng)的發(fā)酵法還是比較缺乏，本論文探索性嘗試以重組大腸桿菌為菌種進行發(fā)酵，并且優(yōu)化了發(fā)酵參數(shù)。
　　本課題首先以大腸桿菌BL21為表達系統(tǒng)，構(gòu)建兩種重組菌BL21-pET-28a-metK和BL21-pET-32a-metK，達到克隆S-腺苷蛋氨酸合成酶基因(metK)的效果，并從分子和蛋白質(zhì)

4、的角度分別證明已成功構(gòu)建了重組載體pET-28a-metK和pET-32a-metK。
　　再利用HPLC對兩種重組菌的SAM產(chǎn)量作了對比，得到高產(chǎn)菌株，命名為ZJGS-SAM，并選出發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件中的六種因素，通過P-B實驗從這六種因素中又得到了三個主要因素:酵母膏、裝液量和pH，利用最陡爬坡實驗得到了三個中心點的濃度，接著通過Box-Behnken Design實驗得到一組可以使產(chǎn)量達到相對較高的一組培養(yǎng)基成分:乳糖

5、20g/L，大豆蛋白胨40 g/L，酵母膏35g/L，NaCl10g/L，MgSO41.2 g/L，L-蛋氨酸1g/L;培養(yǎng)條件為初始培養(yǎng)基pH7.5，誘導溫度33℃，接種量1％，轉(zhuǎn)速220 rpm，裝液量30 mL(250 mL搖瓶)。在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上發(fā)酵12h，對比未優(yōu)化的35 mg/L原是產(chǎn)量，提高了271.4％。
　　通過上罐發(fā)酵進行驗證，在分批發(fā)酵方式下，優(yōu)化了pH條件和通氣量的選擇，產(chǎn)量達到87.88 mg/L，接著