大腸桿菌苯丙氨酸生物合成的調(diào)控研究.pdf

1、研究目的
　　 1.構(gòu)建苯丙氨酸高產(chǎn)菌株，使之適用于工業(yè)化生產(chǎn)，降低甜味劑阿斯巴甜原料苯丙氨酸的成本，進(jìn)而降低阿斯巴甜的成本。
　　 2.搭建大腸桿菌合成代謝基因調(diào)控技術(shù)平臺(tái)，為今后改造大腸桿菌芳香族氨基酸代謝通路打下基礎(chǔ)，不僅可以用來提高天然產(chǎn)生的芳香代謝物苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸生產(chǎn)的產(chǎn)率和產(chǎn)量，還可以利用代謝工程的手段導(dǎo)入外源基因，用來合成其它芳香族化合物如靛藍(lán)、吲哚乙酸、兒茶酚和奎尼酸及其衍生物等。
　　

2、 材料和方法：
　　 以大腸桿菌MG1655為受體菌，以pZE12為載體，對(duì)大腸桿菌苯丙氨酸合成代謝通路進(jìn)行修飾。
　　 1.敲除編碼酪氨酸分支代謝通路上的關(guān)鍵酶基因tyrA；同時(shí)敲除對(duì)pheA功能有抑制作用的基因pheL；為了基因調(diào)控的方便及消除pheA、aroF的本底表達(dá)，同時(shí)敲除基因pheA、aroF。
　　 2.從E.coli中克隆DAHP合成酶基因aroF、分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶基因pheA，并將這

3、兩個(gè)基因串聯(lián)起來，克隆到pZE12中，再把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因敲除菌中進(jìn)行表達(dá)。
　　 3.從E.coli中克隆脫氫奎寧酸合成酶基因aroB和莽草酸激酶基因aroL，并將這兩個(gè)基因串聯(lián)起來，克隆到表達(dá)載體pET22b質(zhì)粒中，再用酶切連接的手段將串聯(lián)起來的基因整合到pZE12 pheA-aroF中，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因敲除菌中進(jìn)行表達(dá)。
　　 4.從E.coli中克隆磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA和轉(zhuǎn)酮酶A基因tktA，并將

4、其串聯(lián)起來，克隆到表達(dá)載體pET22b質(zhì)粒中，再用酶切連接的手段將串聯(lián)起來的基因整合到pZE12 pheA-aroF中，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因敲除菌中進(jìn)行表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR鑒定結(jié)果顯示：pheL、pheA、tyrA、aroF這四個(gè)基因敲除成功。
　　 2.PCR及酶切結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pZE12 AF、pZE12 AFLB和pZE12 AFPT構(gòu)建成功，即pheA和aroF、ppsA和tktA、

5、aroL和aroB基因，兩兩串聯(lián)并被成功克隆進(jìn)質(zhì)粒pZE12中。
　　 3.SDS-PAGE電泳顯示：木實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了pheA和aroF基因編碼蛋白質(zhì)的高表達(dá)，aroB、aroL、ppsA和tktA基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)較低。
　　 4.與野生型MG1655相比，含有pZE12AF的工程菌苯丙氨酸的產(chǎn)量提高了13倍，含有pZE12 AFPT的工程菌苯丙氨酸的產(chǎn)量提高了10.3倍，含有pZE12AFLB的工程菌苯丙氨酸的的產(chǎn)量提