大腸桿菌色氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建.pdf

1、摘要摘要色氨酸( 仃y p t o p h a I l ，T r p ) 是一種重要的營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸，只能由微生物或植物合成。L ．色氨酸是8 種必須氨基酸之一，人和動(dòng)物只能從食物中攝取。本實(shí)驗(yàn)采用誘變育種及基因克隆手段對(duì)一株大腸桿菌進(jìn)行改造，以望獲得能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的【廣色氨酸高產(chǎn)菌株。以大腸桿菌( E s c h e r i c h i a c o t i ) M D ．T 1 0 9 為出發(fā)菌株，經(jīng)N T G 誘變處理，篩選

2、得到7 株酪氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。經(jīng)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸檢測(cè)，其中1 株產(chǎn)酸比出發(fā)菌株降低，4 株產(chǎn)酸與出發(fā)株相當(dāng)，只有兩株L 廣色氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株得到提高，其中．M D ．T 1 0 9 ．0 6 突變株產(chǎn)酸量較出發(fā)菌提高了1 1 ．2 3 ％，生長(zhǎng)速率未受到影響，且遺傳穩(wěn)定性良好。進(jìn)一步對(duì)M D —T 1 0 9 ．0 6 突變株進(jìn)行改造。P C R 擴(kuò)增其U P E D C B A 基因并克隆到含t a c 啟動(dòng)子的p M D ．T 1

3、 0 9 表達(dá)載體中，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主得到工程菌M D ．u p ．0 6 。經(jīng)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸檢測(cè)，其L ．色氨酸產(chǎn)量從0 ．2 0 6 鰣L 提高到0 ．2 3 8 ∥d L ，提高1 5 ．5 ％。工程菌鄰氨基苯甲酸合成酶活性提高1 4 0 ％，色氨酸合成酶活性提高1 6 6 ％。為解決高密度發(fā)酵過(guò)程中通常存在的溶氧限制問(wèn)題，將透明顫菌血紅蛋白基因( v g b ) 弓l A I 程菌M D ．仃p ．0 6 中。根據(jù)G e n b a

4、n k 公布的v g b 基因及其低氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子的序列信息，并按照大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行修飾，人工合成修飾后的v g b 片段，通過(guò)酶切連接將其克隆到表達(dá)質(zhì)粒p M D ．U P ，電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入M D ．仃p ．0 6 ，獲得工程菌M D ．仃p 。經(jīng)低氧誘導(dǎo)v g b 基因的表達(dá)，搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證，在2 5 0 m l 三角瓶中6 0 m l 及1 0 0 m l 裝液量條件下，檢測(cè)到v g b 基因的表達(dá)工程菌相比出發(fā)菌株菌濃分別提高了2

5、 l ％和1 6 ％，色氨酸產(chǎn)量則提高了1 6 ．4 ％和2 1 ％。S D S ．P A G E 檢測(cè)到V H b 蛋白條帶的表達(dá)。關(guān)鍵詞L - 色氨酸；N T G 誘變；T r p E D C B A 基因；透明顫菌血紅蛋白；低氧誘導(dǎo)表達(dá)A b s t r a c tA b s t r a c tl I I l l l I l l I l l l l I l l l I l l lY 1 8 0 6 8 9 1T r y p t o

6、 p h a n i s a n i m p o r t a n t n u t r i e n t e s s e n t i a l a m i n o a c i d ，w h i c h C a l l o n l ys y n t h e s i z e d b y m i c r o o r g a n i s m s o rp l a n t s ．L - T r y p t o p h a n i so n e o f

7、e i g h tk i n d s o f e s s e n t i a la m i n oa c i d s ，h u m a n sa n d a n i m a l s o n l y i n t a k ef r o m f o o d ．I no r d e r t o g e ta L - t r y p t o p h a no v e r p r o d u c i n g s t r a i n s t h a

8、t C a n b e u s e d i n l a r g e ·s c a l e p r o d u c t i o n ，w e m o d i f y aE s c h e r i c h i a c o l is t r a i n M D - T 1 0 9 b y m e a n so f m u t a t i o n b r e e d i n ga n d g e n e c l o n i n g ．

9、E s c h e r i c h i ac o l iM D ．T 1 0 9a st h es t a r t i n gs t r a i nW a s i n c u b a t e db y n i t r o s o g u a n i d i n e( N T G ) t r e a t m e n t ，a n ds e v e n t y r o s i n ea u x o t r o p h i cm u t a

10、n t s t r a i n sw e r es c r e e n e d ．O n eo fw h i c h n a m e dE ．c o l i M D - T 1 0 9 ．- 0 6 s h o w e d i n c r e a s i n g L - - t r y p t o p h a n p r o d u c t i o n b y1 1 ．2 3 ％c o m p a r e dw i t h t h eo

11、 r i g i n a ls t r a i n ．E ．c o l iM D —T 1 0 9 —0 6e x h i b i t e ds i m i l a rg r o w t hr a t ea st h e s t a r t i n gs t r a i na n d s h o w e d g o o dg e n e t i c s t a b i l i t y ．T of u r t h e ri m p r o

12、 v e t h eM D - T 1 0 9 —0 6m u t a n t ，w e a m p l i f i e di t sT r p E D C B A g e n e ，a n dc l o n e di n t oa ne x p r e s s i o nv e c t o rp M D ·T 1 0 9c o n t a i n i n g a t a cp r o m o t e r , t r a n

13、s f o r m e di n t oE ．c o l iM D —T 1 0 9 ．0 6a n d g o ta ne n g i n e e r i n g s t r a i no f E ．c o l iM D - 仃p 一0 6 ．A f t e r f l a s ks h a k ef e r m e n t a t i o n t e s t ，t h eL ．t r y p t o p h a n p r o d

14、u c t i o n o f M D —t r p 一0 6w a si n c r e a s e df r o m 0 ．2 0 6g／d L t o 0 ．2 3 8 9 ／d L ，i n c r e a s e d 15 ．5 ％．T h e a n t h r a n i l a t e s y n t h e t a s e a c t i v i t y o ft h ee n g i n e e r i n g s

15、t r a i n i n c r e a s e d b y 14 0 ％，a n dt r y p t o p h a ns y n t h e t a s e a c t i v i t y i n c r e a s e d1 6 6 ％．T oa d d r e s s d i s s o l v e d o x y g e n l i m i t a t i o n t h a t i s u s u a l l yp r

16、e s e n ti n h i g h —d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ，t h eV i t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n g e n e ( v g b ) w a sc l o n e di n t oe n g i n e e r i n gs t r a i nM D ．t ?。? 6 ．A c c o r d i n g t o p u

17、 b l i s h e d G e n b a n k v g bg e n e a n d i t s i n d u c i b l e p r o m o t e rs e q u e n c ei n f o r m a t i o n ，a n d m o d i f i e da c c o r d i n g t ot h eE ．c o l ic o d o nu s a g e b i a s ．S y n t h

18、e t i cm o d i f i c a t i o nv g bf r a g m e n t W a sc l o n e di n t o t h ee x p r e s s i o n v e c t o rp M D ·t r p ，t r a n s f o r m e di n t o E ．c o l i M D ．t r p 一0 6 ，a n d g e te n g i n e e r e d s

19、t r a i n E ．c o l i M D - t r p ．T h ev g bg e n ew a sh y p o x i a i n d u c e de x p r e s s i o ni ns h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o nu s i n g2 5 0 m l f l a s kw i t h6 0 m la n d10 0 m ll i q u i dv o

20、l u m ec o n d i t i o n s ．A s a r e s u l t ，b a c t e r i ac o n c e n t r a t i o no f E ．c o l iM D - 仃pi n c r e a s e d b y2 1 ％a n d 1 6 ％，c o m p a r e d w i t h E ．c o l i M D - t 印·0 6 ，w h i l et r y p t

21、 o p h a np r o d u c t i o ni n c r e a s e db y16 ．4 ％a n d2 1 ％．r e s p e c t i v e l y ．V H be x p r e s s i o nw a s d e t e c t e db yS D S ．P A G E ．k e y w o r d s ：L —t r y p t o p h a n ；N T Gm u t a g e n e s