基于輔因子調(diào)控的s-腺苷蛋氨酸合成研究.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)是一種在生物中廣泛存在并具有重要生理功能的小分子物質(zhì)。臨床上將SAM用于關(guān)節(jié)炎、肝病、抑郁癥等疾病的治療，效果顯著。目前SAM主要通過(guò)微生物發(fā)酵制備，但存在產(chǎn)量低，前體L-蛋氨酸和ATP供應(yīng)不足等問(wèn)題。
　　研究者試圖通過(guò)代謝工程改造以提高菌株生產(chǎn)SAM的能力，然而SAM在微生物中的代謝途徑冗長(zhǎng)復(fù)雜，而且不是終端代謝產(chǎn)物，僅針對(duì)主代謝途徑中涉及到的基因進(jìn)行分子操作，并不能大幅度提高SAM產(chǎn)量。作為胞內(nèi)重要微

2、環(huán)境的輔因子ATP/ADP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+參與了細(xì)胞內(nèi)大量的反應(yīng)過(guò)程，將物質(zhì)代謝途徑聯(lián)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，最終導(dǎo)致物質(zhì)代謝流的分配受到輔因子形式和濃度的牽制。因此，通過(guò)輔因子工程手段調(diào)控胞內(nèi)代謝物的合成具有極大的潛力。
　　本論文以解析輔因子對(duì)于SAM合成的調(diào)控機(jī)理為目的，通過(guò)代謝工程策略改造大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)胞內(nèi)輔因

3、子形式和濃度，綜合運(yùn)用熒光定量PCR和LC/MS/MS方法分析并總結(jié)輔因子對(duì)于產(chǎn)物合成的生理機(jī)制以及能量代謝和其他物質(zhì)代謝的規(guī)律，為高產(chǎn)SAM的菌株的代謝工程改造提供理論基礎(chǔ)。主要研究工作如下:
　　1.建立基于合成的sRNA技術(shù)用于E.coli體系胞內(nèi)輔因子調(diào)控的系統(tǒng)，通過(guò)干擾基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控胞內(nèi)輔因子水平。構(gòu)建靶向紅色熒光蛋白的sRNA結(jié)合流式細(xì)胞儀和熒光定量PCR，證實(shí)了該策略可有效調(diào)控胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，弱化效率可達(dá)85％。

4、應(yīng)用該策略調(diào)控副產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)消耗ATP和NADPH的代謝途徑相關(guān)基因，構(gòu)建了相應(yīng)的合成sRNA: anti-proB,anti-glnA,anti-argB,anti-aroE,anti-argC,anti-proA，anti-ilvC和anti-proC。通過(guò)熒光定量PCR結(jié)果表明目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度的降低。與對(duì)照菌相比，帶有合成sRNA的重組菌胞內(nèi)ATP水平和NADPH水平均有所提高，胞內(nèi)SAM產(chǎn)量提高約1倍。
　　2.

5、在E.coli中通過(guò)分別引入NADH激酶(pos5p)以及轉(zhuǎn)氫酶(PntAB)和NAD激酶(YfjB)聯(lián)用構(gòu)建兩種NADPH再生系統(tǒng)。分析NADPH濃度、NADPH/NADP+比率變化對(duì)于胞內(nèi)物質(zhì)代謝的擾動(dòng)及產(chǎn)物SAM合成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)通過(guò)NADPH再生系統(tǒng)提高NADPH水平及NADPH/NADP+比率可以有效地促進(jìn)胞內(nèi)SAM的合成。其中基于NADH激酶再生系統(tǒng)使得胞內(nèi)SAM產(chǎn)量提高13倍，產(chǎn)量達(dá)5.30mg/L。
　　3.由于S.

6、cerevisiae中的NADPH在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的代謝相對(duì)獨(dú)立，因此在E.coli的研究基礎(chǔ)上，以S.cerevisiae BY4741單倍體模式菌株為研究對(duì)象，研究了不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)NADPH對(duì)于產(chǎn)物合成的影響。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡證實(shí)了成功在S.cerevisiae線粒體中表達(dá)了NADH激酶(pos5編碼)，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)了不帶信號(hào)肽的NADH激酶(pos5△17編碼)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中NADPH再生的菌株NBYSM-1合成SA

7、M的能力以及NADH/NAD+比率、ATP水平均要明顯高于線粒體中NADPH再生的菌株NBYSM-2，NADPH/NADP+比率低于NBYSM-2。說(shuō)明NADPH對(duì)于菌株合成SAM產(chǎn)量有促進(jìn)作用，ATP對(duì)SAM的合成影響更為重要。
　　4.以S.cerevisiae為研究宿主，在過(guò)表達(dá)sam2的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了多種不同形式的ATP調(diào)控系統(tǒng)，pRS425-PHXT7-noxE-THXT7，pRS425-PHXT7-vhb-THXT7,

8、pRS425-PHXT7-ptxD-THXT7和pRS425-PHXT7-fdh1-THXT7。結(jié)果表明S-腺苷蛋氨酸合成酶活性對(duì)于SAM的合成影響極為重要，過(guò)表達(dá)sam2的菌株胞內(nèi)SAM產(chǎn)量提高一倍。vhb和ptxD對(duì)于胞內(nèi)SAM的合成有較為顯著的促進(jìn)作用，其中菌株ABYSM-2發(fā)酵28 h胞內(nèi)SAM濃度最高，與對(duì)照相比提高67％，可達(dá)54.92 mg/L。借助液質(zhì)結(jié)合代謝組分析，發(fā)現(xiàn)重組菌株和對(duì)照菌株的代謝物差異較大，其中氨基酸途徑