酶法生產(chǎn)s-腺苷蛋氨酸.pdf

1、S-腺苷蛋氨酸(SAM)是由意大利人Cantoni于1953年發(fā)現(xiàn)的。它廣泛存在于各種生物體內(nèi)，參與體內(nèi)40多種生化反應(yīng)，在蛋白質(zhì)、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、磷脂質(zhì)和維生素的合成過(guò)程中起著重要作用。S-腺苷蛋氨酸是一種重要的代謝中間體，對(duì)機(jī)體代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用。SAM是由底物L(fēng)-甲硫氨酸(L-Met)和腺苷三磷酸(ATP)在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosyl-L-Methionine Synthetase，EC2.5.

2、1.6)作用下合成的。SAM目前主要用于醫(yī)藥行業(yè)，在臨床醫(yī)學(xué)上表現(xiàn)出優(yōu)秀的應(yīng)用價(jià)值，可用于肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)炎、性功能障礙及癌癥等疾病的治療。目前生產(chǎn)SAM主要有微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶促轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成法分離純化困難，成本高;微生物發(fā)酵法是目前SAM的主要生產(chǎn)方法，主要是酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)SAM，但是分離純化工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng);酶促轉(zhuǎn)化法是目前生產(chǎn)SAM的研究熱點(diǎn)，與其他兩種方法相比，酶促轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)時(shí)間短、轉(zhuǎn)化率高、分離純

3、化容易、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。但由于生物體內(nèi)SAM合成酶含量比較低、酶活不高，且穩(wěn)定性較差，所以克隆出過(guò)表達(dá)、酶活高、穩(wěn)定性好的SAM合成酶是酶促轉(zhuǎn)化法合成SAM的關(guān)鍵。本論文以大腸桿菌（Escherichia Coli）、嗜熱菌（Thermusthermophilus）基因組為模板擴(kuò)增出SAM合成酶基因MetK、MATTt，以質(zhì)粒pET22b(+)為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌構(gòu)建高產(chǎn)SAM的重組菌，實(shí)現(xiàn)了SAM

4、合成酶的高效表達(dá)，并對(duì)培養(yǎng)條件、反應(yīng)條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究;針對(duì)嗜熱菌來(lái)源的SAM合成酶MATTt進(jìn)行了固定化研究，將其固定在了碳納米管上并對(duì)固定化后的SAM合成酶進(jìn)行了表征;嗜熱來(lái)源的MATTt進(jìn)行了酶分子結(jié)晶及其結(jié)構(gòu)解析，初步揭示了其熱穩(wěn)定的機(jī)理，為酶法生產(chǎn)SAM提供了有價(jià)值的參考。本論文具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、以大腸桿菌染色體DNA為模板，擴(kuò)增得到SAM合成酶基因metK。將所得基因整合到載體pET22b(+)，利用T

5、7強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，以E.coli BL21(DE3)為表達(dá)菌株，構(gòu)建出了具有高效表達(dá)SAM合成酶的基因工程菌，實(shí)現(xiàn)了SAM合成酶基因在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)，計(jì)算得metK酶的酶活為33.42 U/L（相對(duì)于發(fā)酵液體積），是空質(zhì)粒酶活的123.70倍。
　　對(duì)metK酶進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化:最適碳源為乳糖，最適氮源為尿素;誘導(dǎo)劑IPTG添加量為0.25‰，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600值為0.5左右，誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)。優(yōu)化了該酶的反應(yīng)條件:最適反

6、應(yīng)溫度為70℃;最適緩沖液（即pH值）為pH值8.0的Tris-HCl緩沖液;最適離子為Mg2+離子;最適酶量為催化10mmol/L的ATP和L-Met時(shí)，需要的最適酶量為4g/L;ATP為此酶促反應(yīng)的主要抑制性底物。對(duì)酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究:該酶在70℃保存5小時(shí)，酶活力保留80％左右，當(dāng)保存15小時(shí)時(shí)，酶活力只存留15％左右，到25小時(shí)迅速下降至5％左右，保存30小時(shí)后幾乎沒(méi)有酶活。研究了酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果Vmax為0.07 mM/m

7、in，ATP的Km值為4.13mM，L-Met的Km值為2.20mM。
　　2、構(gòu)建了來(lái)源于嗜熱菌（Thermus thermophilus HB27）的含SAM合成酶基因的重組質(zhì)粒pET22b-MATTt。在E.coli-Bl21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了SAM合成酶基因MATTt的過(guò)表達(dá)，并用鎳柱親和層析純化了該酶。計(jì)算得MATTt酶的比酶活為120.5 U/g，酶活為12.70 U/L。
　　研究了MATTt的酶學(xué)性質(zhì):MAT

8、Tt酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)表明結(jié)果Vmax為0.84μmol/min/mg，ATP的KM4.19 mM，L-Met的KM為1.2 mM，與來(lái)源于Thermococcus Kodakarensis的同為嗜熱SAM合成酶的TkMAT相似。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是該酶最突出特點(diǎn)。由圓二色譜圖得出MATTt酶在pH值為5-10之間，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。熱穩(wěn)定性方面，70℃條件下保持24小時(shí)，酶活幾乎沒(méi)有損失。保存36小時(shí)后酶活仍保留60％。
　　考察了MATTt的最適反應(yīng)

9、條件。該酶在較廣的溫度范圍內(nèi)(30℃到90℃)表現(xiàn)出催化活性。酶活隨著反應(yīng)溫度的升高而升高，在80℃催化活性表現(xiàn)最高;MATTt在緩沖液pH值為6-11之間有活性，pH值為8.0時(shí)活性最大;發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)Zn2+顯示離子偏好性。
　　應(yīng)用功能化改造的多壁碳納米管(MWCNTs)為載體對(duì)嗜熱來(lái)源的SAM合成酶MATTt進(jìn)行固定化，催化SAM合成。并對(duì)固定化酶進(jìn)行表征。經(jīng)過(guò)固定化MATTt酶經(jīng)過(guò)4批次反應(yīng)酶活保留80％。
　　3、確

10、定了MATTt蛋白的多個(gè)結(jié)晶條件，獲得了可用于X射線衍射的MATTt蛋白晶體，并運(yùn)用分子置換法解析其結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)MATTt與metK的結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)二者的主要區(qū)別在于之前報(bào)道的“disordered loop”上，與大多數(shù)結(jié)構(gòu)不同的是，MATTt中這段loop區(qū)的密度很好，其中的氨基酸殘基可以全部確認(rèn)。從目前已經(jīng)解析的結(jié)構(gòu)來(lái)看，MATTt的這段loop無(wú)論與metK這段完整的結(jié)構(gòu)或有缺陷的結(jié)構(gòu)相比，都存在著較為明顯的構(gòu)象差異，由此推測(cè)這