大腸桿菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的功能性研究及其藥物虛擬篩選.pdf

1、目前，在感染病領(lǐng)域由耐藥細(xì)菌引起的疾病感染是全球正在關(guān)注的熱點(diǎn)。對藥物的作用靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾可以通過甲基化過程來實(shí)現(xiàn)，這是致病菌一種重要的耐藥機(jī)制。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在細(xì)胞中是一種通用的甲基供體，在甲基循環(huán)中起著非常重要的作用，如果某些關(guān)鍵的蛋白質(zhì)與SAM的生化代謝途徑相關(guān)，那么此蛋白質(zhì)有可能成為一種藥物靶點(diǎn)。在甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用下，S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由甲基供體SAM參與去甲基化反應(yīng)生成。SAH在轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)過程是一種

2、有效的競爭性抑制劑，對細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)有強(qiáng)烈的毒性，能抑制它們的修飾過程。在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，SAH在S-腺苷高半胱氨酸水解酶（SAHH）作用下發(fā)生水解反應(yīng)，只需要一步就生成產(chǎn)物高半胱氨酸和腺苷酸，而在大多數(shù)病原微生物的細(xì)胞內(nèi)沒有表達(dá)SAHH蛋白的能力，SAH只能是在S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)兩種酶的參與下發(fā)生催化分解反應(yīng)，生成腺嘌呤和高半胱氨酸。另外，經(jīng)甲基修飾的供體SAM發(fā)生甲基化反應(yīng)

3、后除生成SAH還能生成甲硫腺苷(MTA)。在很多致病性的病原微生物中，MTA在S-腺苷高半胱氨酸/甲硫腺苷核苷酶（SAHN）作用下發(fā)生分解反應(yīng)，生成腺嘌呤和5'-甲硫核糖(MTR)，MTR立即進(jìn)入下一步反應(yīng)，在5'-甲硫核糖激酶（MTR Kinase）作用下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成的產(chǎn)物是5'-甲硫核糖-1-磷酸(MTRP)。但是，在致病菌的宿主哺乳類等真核細(xì)胞內(nèi)，MTA是通過不同的途徑來進(jìn)行反應(yīng)的，在5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)催化

4、作用下生成MTRP和腺嘌呤。病原微生物和宿主細(xì)胞在是SAH代謝節(jié)點(diǎn)和MTA代謝節(jié)點(diǎn)的不同，使得在致病菌中特有的能分解SAH和MTA反應(yīng)的SAHN核苷酶成為抗感染藥物的一個具有潛力的分子靶標(biāo)。
　　本論文利用Red/ET同源重組法敲除大腸桿菌MG1655的sahn基因，通過同源重組雙交換的方法用卡那霉素抗性基因取代基因組中整個sahn基因的編碼序列。轉(zhuǎn)入重組酶表達(dá)質(zhì)粒以消除抗性篩選標(biāo)記，得到保留單—LoxP位點(diǎn)的突變菌株△sahn。

5、同時，本論文成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-sahn。以IPTG作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過Ni-NTA親和層析對SAHN酶蛋白進(jìn)行純化。用考馬斯亮藍(lán)法測定經(jīng)除鹽濃縮后的蛋白含量約為368μg/mL，根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法計(jì)算SAHN酶蛋白的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)SAHN酶蛋白在不同的表達(dá)水平下，群感效應(yīng)的表征信號分子AI-2和菌膜的形成均有所差異。最后，采用分子對接技術(shù)從小分子數(shù)據(jù)庫中篩選到一種新型抑制劑，