大腸桿菌漆酶（CueO）的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、漆酶是一類廣泛存在于高等和低等生物中的古老酶類，其具有的多酚氧化能力和較寬松的底物特異性使其在造紙、環(huán)保、家具制造和食品生產(chǎn)等行業(yè)具有引人注目的應(yīng)用前景。但是由于天然漆酶生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低，一直無法滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求，高產(chǎn)、高活性重組漆酶的開發(fā)日益成為研究的焦點(diǎn)。CueO為大腸桿菌銅耐受系統(tǒng)重要組成蛋白，參與大腸桿菌周質(zhì)空間中的銅離子解毒過程；同時(shí)該蛋白也是一種細(xì)菌漆酶，可在重組條件下高量表達(dá)，但其氧化能力較真菌漆酶低1～2個(gè)數(shù)量

2、級(jí)。 我們通過克隆表達(dá)獲得CueO重組蛋白，并對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)CueO氧化活性依賴于外源銅離子的存在；為了說明這種依賴性的原因，我們通過懸滴氣相擴(kuò)散法獲得了四種不同外源銅離子存在濃度條件下的CueO蛋白晶體，衍射、收集數(shù)據(jù)并最終解析獲得這四種晶體的三維結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn)不同外源銅離子濃度條件下的晶體中CueO四個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn)的占有率隨外源銅濃度升高依次遞增，結(jié)合氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，CueO氧化能力的銅離子依賴性源于

3、其銅結(jié)合位點(diǎn)的占有率不足。 將CueO三維結(jié)構(gòu)與其他三種已解析的漆酶結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在CueO三核中心溶劑通道Glul06位殘基處，各種漆酶顯示出較大的疏水性差異，按照氧化活性最高的漆酶中的殘基種類將CueO蛋白106位突變?yōu)镻he后，觀察到突變體氧化活性對(duì)外源銅離子的依賴性較母體降低，表明該位置的疏水性對(duì)三核中心銅占有率有影響。同時(shí)，在四種漆酶的結(jié)構(gòu)比對(duì)中還發(fā)現(xiàn)CueO的底物口袋區(qū)域較其他漆酶多出一段α螺旋，阻礙了一型銅與底物的