大腸桿菌非編碼小RNA DsrA核磁結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、大腸桿菌DsrA是被研究得最清楚的調(diào)節(jié)非編碼小RNA之一。它位于調(diào)控莢膜多糖合成基因rcsA下游，全長87個核苷酸，并且調(diào)控時依賴于Hfq蛋白質(zhì)。當(dāng)細菌處于低溫或者酸性條件下，細菌會大量表達D srA sRNA，來調(diào)控rpoS和hns mRNA的活性，激活σS翻譯并且抑制H-NS表達，從而調(diào)控很多基因的轉(zhuǎn)錄。近兩年來，人們又發(fā)現(xiàn)DsrA可以抑制參與細胞壁合成的mreB和參與糖代謝的rbsD mRNA。
　　盡管有大量文獻報導(dǎo)了Ds

2、rA sRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能，但是它的原子分辨率結(jié)構(gòu)仍然不清楚。因此，使用核磁共振技術(shù)研究了DsrA結(jié)構(gòu)。首先，解析了DsrA第一個莖環(huán)(SL1)的三維結(jié)構(gòu)。SL1形成一個標(biāo)準(zhǔn)A型RNA結(jié)構(gòu)，莖部結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，但是由“AUUUC”組成的loop區(qū)柔性很大，具有動態(tài)性。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和核磁共振技術(shù)，證明了rpos mRNA能夠與DsrASL1和隨后的單鏈區(qū)形成堿基配對，在不需要Hfq或者CsdA等蛋白質(zhì)的幫助下，就能打開SL1穩(wěn)定

3、的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　有不同文獻報導(dǎo)了DsrA有三個不同二級結(jié)構(gòu)模型。在這三個模型中，SL1和SL3的序列和二級結(jié)構(gòu)都是一樣的，但是SL2結(jié)構(gòu)卻有很大區(qū)別。進一步確認(rèn)了在NMR條件下SL2的二級結(jié)構(gòu)，并且證明這個二級結(jié)構(gòu)與Lease和Belfort報導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)模型最一致。它的底部堿基配對非常不穩(wěn)定，當(dāng)溫度升高時就會被打開，而頂部可形成相對穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　筆者還發(fā)現(xiàn)SL2可以存在兩種構(gòu)象，而且SL25'端單鏈linker會

4、影響這兩種構(gòu)象的變化。為此，設(shè)計了幾個RNA，分別為Domain235nt(28-60核苷酸)，Domain230nt(33-60核苷酸)and Domain225nt(38-60核苷酸)。通過比較不同RNA的2D1H-1H NOESY譜圖，發(fā)現(xiàn)SL2頂部莖環(huán)會同時存在兩種結(jié)構(gòu)。雖然Domian2所有亞氨基信號都屬于A構(gòu)象，但是另外三個RNA都包含了另外一種構(gòu)象亞氨基信號。當(dāng)在Domain225nt加上更穩(wěn)定底部堿基配對時，兩種構(gòu)象都會

5、出現(xiàn)，而且這兩種構(gòu)象的交叉峰強度基本一樣。
　　雖然SL2結(jié)構(gòu)柔性很大，但是它的亞氨基信號在SL12和SL23中保持一致，說明SL12和SL23都能形成包含兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。但是當(dāng)DsrA全長在高濃度下時，只有SL1形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而SL2和SL3觀測不到任何亞氨基信號，因而沒有形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　RNA是功能最多樣的生物大分子。有時候一個RNA分子同時有多種功能，比如DsrA sRNA。當(dāng)RNA發(fā)揮不同的功能時，它可能