革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌介紹

1、大腸桿菌,大腸桿菌的歷史,腸桿菌科,為革蘭氏陰性桿菌。根據(jù)生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗、DNA同源性研究，腸桿菌科至少包括28個菌屬，110個以上的菌種。埃希菌屬（Escherichia）中最重要的是大腸埃希菌(E. coli) ，常稱為大腸桿菌。大腸桿菌廣泛分布于自然界，包括腐生菌、寄生菌和人及動物的病原菌。多數(shù)是人和動物腸道正常菌群的重要成員。20世紀(jì)中葉，認(rèn)識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒和幼畜（禽），常引

2、起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。,一 、大腸桿菌的一般特性,1、G－直短桿菌，兩端鈍圓，散在或成對。,,革蘭染色,2、周身鞭毛，能運動，無芽孢 ，有的有莢膜。3、代謝能力強(qiáng)，代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型 。,,二 、培養(yǎng)及生化特性,1、培養(yǎng)特性 ① 兼性厭氧；　　　?、?最適生長溫度37℃，最適生長pH7.2～7.6；　　　?、?普通瓊脂培養(yǎng)基：生長良好，圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落，直徑約2~3mm；④ 普通肉湯培養(yǎng)基：均勻渾

3、濁，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌環(huán)。,⑤ 腸道菌鑒別培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：紅色菌落。伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基：黑色帶金屬閃光的菌落。SS瓊脂培養(yǎng)基：一般不生長或生長較差，生長者呈紅色。 ⑥血平板：一些致病性菌株常β溶血。,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基,SS瓊脂培養(yǎng)基,血平板,2、 生化特性,,I：吲哚試驗M：甲基紅試驗V：V-P試驗C：枸櫞酸鹽利用實驗,（1）三糖鐵培養(yǎng)基①配方牛肉膏 5g

4、 硫酸亞鐵 0.2g氯化鈉 5g 蒸餾水 1000mL蛋白胨 20g 硫代硫酸鈉 0.2g蛋白胨 5g 瓊脂 1 2g乳糖 10g 2%酚紅溶液 12.5ml蔗

5、糖 10g葡萄糖 1g,②原理測定細(xì)菌對葡萄糖、乳糖及蔗糖的發(fā)酵反應(yīng)，以及能否產(chǎn)生硫化氫?？设b別腸道菌。,,,,葡萄糖乳糖蔗糖硫酸亞鐵,,,,大腸桿菌,沙門菌,能產(chǎn)硫化氫菌株,發(fā)酵葡萄糖和乳糖；大量產(chǎn)酸產(chǎn)氣,,底層和斜面均呈黃色，底層有氣泡,只發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,,,底層黃色，斜面保持紅色,因形成硫化亞鐵而使培養(yǎng)基呈黑色,對照,假單胞菌,志賀氏菌,沙門氏菌,大腸桿菌,變形桿菌,三糖鐵培養(yǎng)

6、基,吲哚試驗,V-P試驗,,枸櫞酸鹽試驗,甲基紅試驗,IMViC試驗,三、大腸桿菌的基本結(jié)構(gòu),(一)細(xì)胞壁 大腸桿菌的細(xì)胞壁分外膜和肽聚糖層。外膜是大腸桿菌細(xì)胞壁的主要成分，主要由磷脂、蛋白質(zhì)和脂多糖組成。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素，也是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的特有成分，主要與抗原性、致病性及對噬菌體的敏感性有關(guān)。,,外膜,周質(zhì),細(xì)胞質(zhì)膜,（二）質(zhì)粒F因子：又稱致育因子，插入、復(fù)制和轉(zhuǎn)移的功能。有F因子的大腸桿菌為雄性，用F+

7、表示，不含F(xiàn)因子的大腸桿菌稱為雌性，用F-表示。通過F+和F-細(xì)菌的接合，F(xiàn)因子可經(jīng)性菌毛傳遞給F-菌株，使F-菌株轉(zhuǎn)變?yōu)镕+菌株。R因子 ：抗性轉(zhuǎn)移因子和抗性決定因子 。Col因子：產(chǎn)大腸桿菌素因子，編碼合成大腸桿菌素 。,四、大腸桿菌的特殊結(jié)構(gòu),1、莢膜 莢膜具有抗原性，構(gòu)成了大腸桿菌的表面抗原，即K抗原 。2、鞭毛由鞭毛蛋白組成，構(gòu)成了細(xì)菌的鞭毛抗原，與運動有關(guān)。3、菌毛 在細(xì)胞表面還含有一種比鞭毛更細(xì)更短更硬的絲狀

8、體叫菌毛，可分為普通菌毛和性菌毛。,,大腸桿菌可以透過接合作用傳遞遺傳物質(zhì)。,五、抗原及血清型,（一）抗原O抗原，即菌體抗原，為細(xì)胞壁脂多糖。該抗原刺激機(jī)體主要產(chǎn)生IgM類抗體。H抗原， 即鞭毛抗原 ，H抗原主要刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG類抗體，與其他腸道菌基本無交叉反應(yīng)。K抗原，即莢膜抗原，位于O抗原外層，為多糖。具有K抗原的菌株不能被其相應(yīng)的抗O血清所凝集叫“O不凝集性”。據(jù)耐熱性不同，K抗原又分為：L、A和B 三型。,L型K抗原：

9、對熱敏感，100℃ 1h破壞其抗原性，并失去與相應(yīng)抗體的結(jié)合力和凝集性，位于被膜中，偶見于莢膜中。A型K抗原：耐100℃ 1h ，但121℃ 2.5h破壞其抗原性和O不凝集性，但保留與相應(yīng)抗體結(jié)合能力。位于莢膜中，抗A血清可使具有相應(yīng)A抗原的菌體出現(xiàn)莢膜腫脹現(xiàn)象。B型K抗原：100℃ 1h 破壞其抗原性與相應(yīng)抗體的凝集性，但保留其與相應(yīng)抗體結(jié)合力。,（二）血清型可用O:K:H排列表示其血清型。如：O8:K23:H19，表示該菌具有

10、O抗原8，K抗原23，H抗原為19。致人畜腹瀉的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，除含K抗原外，還可含有蛋白質(zhì)性粘附素抗原。對粘附素抗原應(yīng)并列寫于多糖K抗原之后。如：O8:K87，K88:H19 中 K88即為粘附素抗原。,六、致病性,（一）致病物質(zhì)1、定居因子（Colonization factor ，CF）；也稱粘附素，即大腸桿菌的菌毛。2、腸毒素是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌在生長繁殖過程中釋放的外毒素，分為耐熱和不耐熱兩種。①耐熱（ST）：100℃

11、20min不破壞，免疫原性弱。②不耐熱（LT）：65 ℃30min破壞，免疫原性強(qiáng)。3．其他：細(xì)胞壁脂多糖的類脂A具有毒性；K抗原有抗吞噬作用，有抵抗抗體和補(bǔ)體的作用 。,,（二）所致疾病1．腸道外感染：多為內(nèi)源性感染，以泌尿系感染為主；大腸桿菌可侵入血液，引起敗血癥；大腸桿菌性腦膜炎 。2．急性腹瀉（1）腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）（2）產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC）（3）腸致病性大腸桿菌（EPEC）（4）腸出血性大腸

12、桿菌（EHEC）（5）腸侵襲性大腸桿菌（EIEC ）（6）腸粘附性大腸桿菌（EAEC）,腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）,ETEC是致人和幼畜腹瀉最常見的病原菌；毒力因子有粘附素性菌毛和腸毒素。,致病過程,七、抵抗力,大腸桿菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)。55℃加熱60min或60℃加熱15min仍有部分細(xì)菌存活。膽鹽、煌綠等對非致病性大腸桿菌有選擇性抑制作用，而對致病性大腸桿菌無抑制作用，所以用腸道選擇鑒別培養(yǎng)基來分離致病性大腸桿

13、菌。對磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感。,八、非致病性大腸桿菌的作用,保護(hù)腸道的微生態(tài)平衡。消耗腸道內(nèi)的氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，利于厭氧菌的生長；分解代謝產(chǎn)物供厭氧菌生長。能合成維生素K和B。對外襲菌有拮抗作用。某些大腸桿菌能產(chǎn)生大腸菌素，對一些病原微生物具有拮抗作用。,九、微生物學(xué)的診斷,1、病料的采集：腸道外感染取中段尿、血液、膿液、腦脊液等，腹瀉者取糞便。2、分離培養(yǎng)：糞便標(biāo)本直接接種腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基。其他病料可同時接種血瓊脂

14、平板和腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)18～24h后，觀察菌落并涂片染色鏡檢。3、生化鑒定：大部分菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和木膠糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣。IMViC試驗為“+ + - -”。即為典型大腸桿菌。,病料,腹瀉或水腫病例,敗血癥病例,常采集糞便或腸粘膜刮取物,常采集血液及其病變組織,麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板劃線,血瓊脂或麥康凱瓊脂平板劃線,挑取疑似大腸桿菌菌落5～10個分別在瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng),革蘭染色

15、鏡檢,接種TSI瓊脂培養(yǎng)基,革蘭氏染色陰性,生化試驗,血清學(xué)鑒定,豬水腫病菌株,豬腹瀉菌株,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Stx2e檢測,腸毒素檢測,臨床上只檢測O抗原,4、血清型鑒定,假定試驗：取經(jīng)生化試驗證實的大腸桿菌培養(yǎng)物，用致病性大腸桿菌，侵襲性大腸桿菌和產(chǎn)毒素大腸桿菌多價O血清和出血性大腸桿菌的O157血清做玻片凝集試驗。當(dāng)與某一種多價O血清凝集時，在與該多價O血清的單價O血清做實驗。如與某一單價O血清發(fā)生強(qiáng)

16、凝集反應(yīng)，則為假定試驗陽性。證實試驗：制備O抗原懸液。原效價為1：160～1：320的O血清，用0.5%鹽水稀釋至1：40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內(nèi)等量混合，做試管凝集試驗?；靹蚝蠓庞?0℃水浴箱內(nèi)，經(jīng)16h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集，可證實為該O抗原。,假定試驗,大腸桿菌培養(yǎng)物,致病性大腸桿菌多價O血清,侵襲性大腸桿菌多價O血清,產(chǎn)毒素大腸桿菌多價O血清,出血性大腸桿菌O157血清,玻片凝集試驗,證

17、實試驗,O抗原懸液,O血清,試管內(nèi)等量混勻,50℃水浴箱，16h,結(jié)果判定,,,,,,,,,,,,,,,試管凝集試驗,,5、Stx2e的檢測 （1）Vero細(xì)胞毒性試驗；（2）小鼠神經(jīng)毒性試驗； （3）抗Stx2e抗體中和試驗；（4）PCR方法對Stx2e基因特異序列的擴(kuò)增。6、ETEC腸毒素檢測 （1）檢測LT的常用方法:兔回腸結(jié)扎腸試驗；ELISA；中國地鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)法；平板免疫溶血試驗；

18、 （2）檢測ST常用方法有：乳鼠胃內(nèi)投服試驗；GM1-ELISA等。,十、衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢查 1、細(xì)菌總數(shù)：檢測每毫升或每克樣品中所含細(xì)菌數(shù)，采用傾注培養(yǎng)計算。2、大腸菌數(shù)檢驗：指100g1000mL水中所含大腸菌群的最近似數(shù)（MPN），采用乳糖膽鹽發(fā)酵試驗檢測。,乳糖膽鹽發(fā)酵試驗,發(fā)酵試驗,分離培養(yǎng),復(fù)發(fā)酵試驗,,,,食品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：含乳蛋白冷凍飲品菌落總數(shù)應(yīng)小于25000cfu/ml，大腸菌群小于450MPN