大腸桿菌I型群體感應(yīng)功能研究.pdf

1、大腸桿菌I 型群體感應(yīng)功能研究F u n c t i o n o f Q u o r u m S e n s i n g - - Ii n v o l v e di n博士生：羊揚(yáng)導(dǎo)師：朱國強(qiáng)專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)揚(yáng)州大學(xué)2 0 1 4 年6 月?lián)P州大學(xué)博士學(xué)位論文供A I ．1 的菌株源，阻礙了病原性大腸桿菌I 型群體感應(yīng)系統(tǒng)功能的深入探討，并引發(fā)腸道環(huán)境中是否存在激活大腸桿菌I 型群體感應(yīng)系統(tǒng)的外源A 甩的質(zhì)疑。事實(shí)上，之前研究人員通過多

2、種手段進(jìn)行篩選，均沒有成功先例。在牛瘤胃中，雖然分泌合成這些特定A H L信號分子的特定細(xì)菌同樣一直沒有成功分離，然而多種Q S ．I 型系統(tǒng)信號分子?；呓z氨酸內(nèi)酯( A H L ) 卻在牛瘤胃中存在，成功分離，并對其功能進(jìn)行檢測；這些A H L 信號分子被認(rèn)為在牛消化道內(nèi)參與調(diào)節(jié)食源性病原菌基因表達(dá)和調(diào)控，在病原菌通過胃腸消化道及消化道內(nèi)生存定殖進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。其中，A H L 信號對病原大腸桿菌0 1 5 7 “ } 1 7

3、致病過程的調(diào)節(jié)尤為引起研究人員關(guān)注，顯得尤為重要。鑒于上述研究積累和A H L 陽性菌必然存在的理論推測，我們在牛瘤胃菌平臺上進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)出一種改進(jìn)的A H L 陽性菌分離方案，在牛瘤胃和豬腸道內(nèi)成功篩選出A 甩陽性菌，并就A H L 產(chǎn)生的特征、功能和病原大腸桿菌互作進(jìn)行了深入探析。富集、蒸發(fā)和濃縮等重要步驟增加在改進(jìn)的篩選流程中，由牛瘤胃液中成功分離了一株銅綠假單胞菌，命名為Y Z l ，并對其合成A H L 的能力進(jìn)行鑒定?；?/p>

4、J Z A l 報(bào)告茵中含有腸記報(bào)告基因，在A H L 存在環(huán)境中能夠激活半乳糖苷酶活性的特性，其探測范圍和對～．1 敏感度較高，我們選定該報(bào)告菌定量檢測Y Z l 產(chǎn)A H L能力，發(fā)現(xiàn)在6 h 時合成能力達(dá)到最高峰：1 6 s r D N A 法被運(yùn)用于對Y Z l 菌的鑒定，確認(rèn)其為銅綠假單胞菌；考慮到僅利用J Z A l 檢測而可能產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，利用C V 0 2 6 報(bào)告菌在感知到外源A H L 的環(huán)境中激活紫色色素合成的

5、特性，進(jìn)一步確認(rèn)其A H L 合成能力；隨后利用p S B 4 0 1 、p S B l l 4 2 兩株報(bào)告菌分別用于感知短鏈、長鏈A H L 并對Y Z l 合成A H L的種類進(jìn)行檢驗(yàn)；利用液質(zhì)聯(lián)譜，在Y Z l 培養(yǎng)上清中鑒定出至少三種不同的A H L 分子，包括C 4 ．H S L 、C 8 ．H S L 、3 - o x o ．C 1 2 ．H S L 。將銅綠假單胞菌Y Z l 株中短鏈和長鏈A H L 的合成基因l a

6、s I 及r h l l 分別克隆入0 1 5 7 ：H 7 大腸桿菌，成功賦予其自身合成A H L 的能力，并進(jìn)一步證明銅綠假單胞茵合成的A H L 能調(diào)控大腸桿菌相應(yīng)基因表達(dá)，激活S d i A 受體蛋白表達(dá)上調(diào)約1 ．7 倍：泳動實(shí)驗(yàn)和耐酸性實(shí)驗(yàn)表明，銅綠假單胞菌合成的A H L 調(diào)控大腸桿菌的生理代謝，受調(diào)控重組大腸桿菌運(yùn)動性下降2 5 ％，耐酸性提高約4 倍，且上述表型變化與鞭毛F I i C 編碼基因的4 倍下調(diào)、g a d