微生物酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸和L-色氨酸的研究.pdf

1、L-半胱氨酸與L-色氨酸在醫(yī)藥、食品和飼料等領域均具有非常廣泛的用途。近年來,各行業(yè)對L-半胱氨酸與L-色氨酸的需求量日益增加,而現(xiàn)有產(chǎn)量遠不能滿足國內(nèi)外市場的需求。因此,開發(fā)微生物酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸與L-色氨酸的工藝路線具有廣闊的應用前景。 本實驗室從富含DL-ATC的環(huán)境中篩選獲得一株惡臭假單胞菌TS1138菌株,前期研究表明,該菌株能以DL-ATC為底物經(jīng)由S-代途徑酶法合成L-半胱氨酸。 本研究首先克隆鑒定了T

2、S1138菌株酶法轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代謝途徑中的另一個重要基因L-半胱氨酸脫毓基酶,并將其在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了重組表達以及分離純化,并對其酶學性質(zhì)進行了考察,發(fā)現(xiàn)了羥胺可以作為其有效的抑制劑。 為了證明在TS1138菌株酶法轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸的過程中,L-半胱氨酸脫巰基酶對L-半胱氨酸的分解起關鍵作用,本研究建立了一種從蛋白水平分離L-半胱氨酸脫巰基酶的技術。以純化的L-半胱氨酸脫巰

3、基酶重組蛋白免疫小鼠,制備得到L-半胱氨酸脫巰基酶抗體。通過Protein A的生物橋聯(lián)作用,將該抗體固定于纖維素磁性微球上,制備得到纖維素免疫磁性微球,該微球能夠特異性分離TS1138菌體裂解液中的L-半胱氨酸脫巰基酶,并且具有良好的重復利用性能。利用經(jīng)過該免疫磁性微球處理后的TS1138菌體裂解液轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸,轉化率達到了96.4％,比原始水平提高了33.7％,并且保持穩(wěn)定,從而證明了L-半胱氨酸脫巰基酶是導致L

4、-半胱氨酸產(chǎn)率降低的關鍵因素。 為了研究該代謝途徑,本研究還利用蛋白質(zhì)組學實驗分析了DL-ATC對TS1138菌體總蛋白表達的誘導作用,發(fā)現(xiàn)在不同誘導條件下,至少有十二種蛋白在表達量上出現(xiàn)了三倍以上的差異。而實時熒光定量PCR實驗則表明了L-ATC水解酶、L-SCC酰胺水解酶和L-半胱氨酸脫巰基酶酶基因在DL-ATC誘導條件下的表達量分別為無誘導條件下的143、162和159倍。另外,本研究還利用人工Mu轉座技術,構建了TS11

5、38菌株的Mu轉座隨機突變文庫,獲得4,000余株突變子。以合成L-半胱氨酸能力為篩選指標,對1,000余株突變子進行了篩選,發(fā)現(xiàn)有二十余株突變子合成L-半胱氨酸的能力表現(xiàn)為缺失或大為降低。 為了提高L-半胱氨酸產(chǎn)率,必須消除或抑制L-半胱氨酸脫巰基酶的作用,然而L-半胱氨酸脫巰基酶為TS1138菌株的必需基因,無法從基因水平敲除。因此,本研究建立了以TS1138菌體全細胞為酶源,以羥胺為L-半胱氨酸脫巰基酶抑制劑,重復利用酶源

6、細胞連續(xù)多次轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸的生產(chǎn)工藝。首先對酶促反應條件進行了優(yōu)化,在最適反應條件下,底物轉化率可達到95.6％,在酶源細胞的6次重復利用過程中,底物的轉化率均可保持在90％以上。隨后建立了產(chǎn)物L-半胱氨酸的分離純化工藝。先將酶促反應液中的L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸；之后經(jīng)樹脂吸附、等電點沉淀等方法純化獲得L-胱氨酸,純度達到99.1％,收率為78.6％；最終再通過電解還原的方法將L-胱氨酸還原為L-半胱氨酸。

7、 此外,在酶法轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸的生產(chǎn)工藝基礎上,本研究還建立了利用色氨酸酶轉化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的生產(chǎn)工藝。 克隆了大腸桿菌JM109菌株的色氨酸酶基因,并將其在大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達。通過對誘導表達條件的優(yōu)化,重組表達的色氨酸酶活力達到宿主菌的約110倍。此外,還利用PCR介導定點突變技術對色氨酸酶氨基酸序列上的四個位點進行了突變(F231R,A232D,A265R與V274R

8、),結果分別導致了色氨酸酶活力降低或完全失活,表明上述四個氨基酸位點均對維持色氨酸酶的活力具有重要作用。 最后利用高效表達色氨酸酶的大腸桿菌酶源細胞,以L-半胱氨酸和吲哚為底物,進行了酶促反應合成L-色氨酸的研究。對酶促反應條件進行了優(yōu)化,在最適反應條件下,L-半胱氨酸的轉化率約為81.5％,吲哚的轉化率約為79.1％。此外,本研究還建立了L-色氨酸的分離純化工藝,通過串聯(lián)使用兩種樹脂排除反應液中其它物質(zhì)的干擾,再經(jīng)洗脫、減壓濃