基因組代謝網絡模型方法模擬重組大腸桿菌生產羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿的研究.pdf

1、目的：
　　將基因組規(guī)模代謝網絡模型與代謝工程（重組大腸桿菌生產羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿）結合，對大腸桿菌模型進行相關途徑修改后，對比不同分析方法的模擬效果，以及預測可行的基因敲除策略，并優(yōu)化M9培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的條件和嘗試重組葫蘆巴堿合成酶的表達生產。
　　方法：
　　1.下載大腸桿菌BL21(DE3)的代謝網絡模型:iB21_1397，并添加合成羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿的合成途徑，形成兩個新的模型。
　

2、　2.對未修改的iB21_1397模型進行基本的FBA(flux balance analysis)分析，以及必需基因預測，指導M9培養(yǎng)基的優(yōu)化。
　　3.將添加代謝途徑后的產羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿模型，進行細胞生長表型的模擬，并且結合使用FVA、OptKnock、GDLS、IdealKnock等不同方法進行基因敲除策略的預測，比較各模擬結果的差異。
　　4.根據模擬結果設計五組改良后的M9培養(yǎng)基:葡萄糖組、甘油組、葡萄

3、糖鐵組、葡萄糖甘油組和倍量葡萄糖組。制備懸菌液后各接種0.1 mL至新鮮的各種改良M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)。研究菌落數生長差異時，在培養(yǎng)12 h后，接種至LB瓊脂培養(yǎng)基中，18h后計數。研究對數生長期菌落數差異時，則分別在培養(yǎng)12h、18h、24 h后，接種至各種相應的M9瓊脂培養(yǎng)基中，72 h后計數。
　　5.通過基因庫里的葫蘆巴堿合成酶CTgS2(BAC43759.1)的信息，合成基因片段，利用限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ在pET2

4、4a(+)的酶切位點，將基因片段與載體pET24a(+)連接。將連接產物轉化進大腸桿菌DH5α，挑取轉化子進行擴增培養(yǎng)，并提取質粒進行酶切和測序驗證。將驗證正確的重組質粒進行復制擴增后轉化進大腸桿菌BL21(DE3)表達，對轉化成功的細菌在相同的培養(yǎng)條件下，以終濃度為0.3 mM、0.6 mM、1mM的IPTG以及終濃度為0.8 g/L的TNDA-1蛋白促進劑為誘導劑，分別誘導6h、8h、10h。誘導結束后將細菌體破碎并進行SDS-PA

5、GE電泳，觀察重組蛋白的表達情況。
　　成果：
　　1.成功實踐了代謝網絡模型的改造和修改，F(xiàn)BA各分析方法基本都能執(zhí)行成功，并與文獻實驗數據進行比對。
　　2.用代謝網絡模型預測了促進羥基-L-脯氨酸產量的基因敲除策略:可通過敲除酮戊二酸脫氫酶、果糖6-磷酸醛縮酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸甘油酸酯脫氫酶實現(xiàn)合成酶的過表達，該策略結合比對其他分析結果后發(fā)現(xiàn)其具有一定可信度。
　　3.用代謝網絡模型預測了促進葫蘆巴堿產

6、量的基因敲除策略:可通過敲除乙醛脫氫酶、蘋果酸酶、丙酮酸激酶、轉氫酶實現(xiàn)合成酶的過表達。
　　4.M9培養(yǎng)基優(yōu)化實驗方面，就碳源的選擇而言，葡萄糖的增菌效果是較甘油明顯的。培養(yǎng)基中添加Fe2+或增加同類碳源濃度，都能促進細菌生長，且增菌效果沒有明顯的差異，只有在培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)差異，基本符合模擬結果。
　　5.重組葫蘆巴堿合成酶研究方面，重組質粒經過酶切和測序驗證后轉化進大腸桿菌BL21(DE3)，進行不同濃度誘導劑和不同

7、誘導時間的蛋白誘導，經SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)各條件下都沒有順利誘導出目標蛋白。但是通過本實驗，對重組蛋白技術有了一定的認識，并在連接載體的選擇、基因重組驗證等技術方面積累了相關的經驗。
　　結論：
　　1.代謝工程可以便利地結合基因組規(guī)模代謝網絡模型進行模擬和分析，而FBA分析則在預測最大產量和預估可提升空間的方面有很大的指導作用。
　　2.用IdealKnock方法篩選的備選敲除反應比用FVA方法篩選的要更有效，

8、更適合用于OptKnock進行基因敲除預測。
　　3.OptKnock方法雖然在預測基因敲除方面耗時較長，但是只要結合適合的模型反應預處理方法，計算成功率比GDLS方法高。
　　4.經過模擬預測，對于重組大腸桿菌生產羥基-L-脯氨酸的代謝網絡模型，敲除酮戊二酸脫氫酶(AKGDH)、果糖6-磷酸醛縮酶(F6PA)、異檸檬酸裂合酶(ICL)、磷酸甘油酸酯脫氫酶(PGCD)，可以有利于脯氨酸4-羥化酶的過表達。
　　5.對于

9、重組大腸桿菌生產葫蘆巴堿的代謝網絡模型，敲除乙醛脫氫酶(ALDD2y)、蘋果酸酶(ME2)、丙酮酸激酶(PYK)、NAD(P)轉氫酶(THD2pp)，可以有利于葫蘆巴堿合成酶的過表達。
　　6.代謝網絡FBA分析的模擬結果，對M9培養(yǎng)基的優(yōu)化具有很強指導意義，對于細胞生長，加入適當量的Fe2+，可以有效地促進生長，無需靠提高葡萄糖的濃度，碳源方面，葡萄糖在促進細胞生長方面比甘油稍優(yōu)，但是如果生產中需要使用甘油，需要適當地提高甘油濃