蘋果多胺和脯氨酸合成代謝相關基因的功能鑒定.pdf

1、多胺不僅調節(jié)植物的生長發(fā)育，還參與逆境響應，而脯氨酸則是一種重要的滲透保護物質。多胺和脯氨酸的生物合成代謝由一系列酶催化完成，如多胺生物合成途徑中的精氨酸脫羧酶（ADC）和精胺合成酶（SPMS），脯氨酸代謝中的重要酶△1-吡咯琳-5-羧酸脫氫酶（P5CDH）等。為研究多胺和脯氨酸合成代謝的分子機理，本研究從‘Gala’蘋果中克隆了MdADC、MdACL5、MdSPMS和MdP5CDH基因，其中MdADC編碼ADC，MdACL5和MdSP

2、MS均編碼SPMS，MdPSCDH編碼P5CDH，通過基因表達分析和轉基因功能鑒定等方法，鑒定了這些基因的生物學功能。主要研究結果如下：
　　 1.克隆了MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的cDNA全長，構建植物表達載體pBI121-MdADC、pBI121-MdSPMS和pBI121-MdACL5，采用農(nóng)桿菌介導法，將它們分別導入煙草Nc89，獲得了各基因的轉基因植株。
　　 2.半定量RT-PCR分析和高效液

3、相色譜（HPLC）測定表明MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的過量表達均導致轉基因煙草內(nèi)源多胺含量增加，轉基因煙草表現(xiàn)出植株矮化、節(jié)間縮短和葉面積增大等表型。
　　 3.非生物脅迫抗性分析發(fā)現(xiàn)，MdADC、MdSPMS和MdACL5轉基因煙草均對PEG、低溫和鹽等脅迫表現(xiàn)高抗。在三種脅迫下，與非轉基因對照相比，各轉基因株系均表現(xiàn)出更高的多胺含量、脯氨酸含量、抗氧化酶（SOD、POD和CAT等）活性、根系活力以及更低的MD

4、A含量和相對電導率。同時發(fā)現(xiàn)，與MdACL5相比，MdSPMS轉基因煙草的相關表型及抗性更明顯。
　　 4.從蘋果中克隆分離出了MdP5CDH基因的cDNA全長；半定量RT-PCR分析表明，該基因在蘋果各組織器官中組成型表達，開放花中表達最高；同時發(fā)現(xiàn)該基因的表達受低溫誘導。
　　 5.構建了MdPSCDH基因標簽蛋白大小不同的原核表達載體pET-30a-MdP5CDH和pGEX-MdP5CDH，經(jīng)IPTG誘導分別得到6

5、5.14 kDa和88.44 kDa特異蛋白產(chǎn)物，確定該基因編碼蛋白大小為61.74 kD。
　　 6.構建了MdP5CDH的正義表達載體pJIT166-MdP5CDH和反義抑制載體pBI121-RevMdP5CDH，并利用農(nóng)桿菌介導法將它們分別導入‘王林’愈傷組織。半定量RT-PCR分析表明，轉正義基因的愈傷組織中MdP5CDH過量表達，而轉反義基因的愈傷組織中MdP5CDH表達受抑制。
　　 7.MdP5CDH過量表