CDK11家族激酶對(duì)PAK1的磷酸化調(diào)控及在細(xì)胞周期中的功能研究.pdf

1、經(jīng)典的CDK(cyclin dependent kinase)家族分子參與真核細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控。CDK11家族蛋白已發(fā)現(xiàn)三個(gè)成員:CDK11p110、CDK11p58和CDK11p46。CDK11p110廣泛表達(dá)于各個(gè)組織和細(xì)胞周期,主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和前體mRNA的剪切過(guò)程。CDK11p46是在某些凋亡信號(hào)刺激下,大的CDK11家族分子被剪切形成的含有C端激酶結(jié)構(gòu)域的小分子,其功能與細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn),在誘導(dǎo)

2、3T3細(xì)胞失巢凋亡的過(guò)程中,CDK11p46可被誘導(dǎo)表達(dá),并且CDK11p46與PAK1(p21 activated kinase 1)分子相互結(jié)合并抑制了PAK1的激酶活性。進(jìn)一步的研究證明PAK1被抑制之后,對(duì)BAD分子的抑制性磷酸化(Ser112和Ser136兩個(gè)絲氨酸位點(diǎn))降低,從而B(niǎo)AD的線粒體轉(zhuǎn)位增加,造成細(xì)胞色素c的釋放,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。CDK11p46對(duì)PAK1的抑制作用和CDK11p46的激酶活性有關(guān),激酶活性缺失的

3、D149N不能抑制PAK1激酶的活性和BAD的磷酸化狀態(tài),因此不能使細(xì)胞發(fā)生凋亡。CDK11p58是最早發(fā)現(xiàn)的CDK11家族成員,在β1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1的分離純化中得到,能磷酸化β1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1并對(duì)β1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1的活性起增強(qiáng)作用。CDK11p58在細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)于G2/M期,過(guò)表達(dá)CDK11p58的細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞周期變化,有絲分裂障礙,細(xì)胞阻滯于G2/M期。過(guò)表達(dá)CDK11p58能增強(qiáng)某些凋亡刺激造成的

4、細(xì)胞凋亡。cdc2L基因敲除的小鼠導(dǎo)致的早期胚胎凋亡中,伴隨有胚胎細(xì)胞有絲分裂停滯等現(xiàn)象,也提示了CDK11p58在真核細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮很關(guān)鍵的作用。CDK11p58對(duì)有絲分裂紡錘體的組裝成熟和維持正常有絲分裂的進(jìn)行起重要作用,進(jìn)一步有人報(bào)道CDK11p58亦在維持姐妹染色單體的正常形態(tài)和正常分離發(fā)揮作用。雖然CDK11p58參與了有絲分裂M期的調(diào)控,但具體的分子機(jī)制尚不清楚。
　　 PAK1屬于一類絲/蘇氨酸蛋白激酶家

5、族p21 activated kinase family之一員,在各個(gè)組織廣泛表達(dá)并通過(guò)依賴或者不依賴于其激酶活性的方式參與調(diào)控一系列廣泛的生理過(guò)程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,比如細(xì)胞生存信號(hào)、增殖、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)改變和細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及腫瘤發(fā)生等。有絲分裂M期細(xì)胞Pak1T212位磷酸化增強(qiáng)且胞內(nèi)定位發(fā)生改變,T212磷酸化的PAK1主要定位于中心體附近,而與CDK11p58的M期定位大致相同。CDK11p58與PAK1之間的聯(lián)

6、系至今未有報(bào)道。我們的研究表明PAK1可作為CDK11p58激酶的體外底物。通過(guò)構(gòu)建PAK1的缺失突變體和點(diǎn)突變體,我們發(fā)現(xiàn)研究表明絲氨酸174位是其體外的磷酸化位點(diǎn)。體內(nèi)的磷酸化實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)CDK11p58可磷酸化修飾PAK1Ser174位點(diǎn)。通過(guò)定點(diǎn)誘變我們構(gòu)建了模擬Ser174位點(diǎn)持續(xù)磷酸化和去磷酸化的突變體174E和174A。我們發(fā)現(xiàn)174E在細(xì)胞M期的定位類似于以前報(bào)道的野生型PAK1的定位,而174A失去了這種特異的定位形式。

7、進(jìn)一步的研究表明相比174A,174E與DLC2(Dynein light chain 2)的結(jié)合明顯增強(qiáng)。體外的直接結(jié)合實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CDK11p58激酶處理后的His-PAK1與DLC2的結(jié)合能力上升。DLC2在體內(nèi)與myosinV形成蛋白復(fù)合物,通過(guò)年免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)我們同樣發(fā)現(xiàn)174E與myosinV復(fù)合物的結(jié)合也強(qiáng)于174A。這說(shuō)明在細(xì)胞M期的進(jìn)展過(guò)程中,CDK11p58激酶可能通過(guò)對(duì)PAK1Ser174位點(diǎn)的磷酸化修飾調(diào)節(jié)其亞細(xì)

8、胞定位。在進(jìn)一步的功能研究中,我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PAK1174E和174A的A375黑色素瘤細(xì)胞株,通過(guò)改良的MTT生長(zhǎng)曲線測(cè)定我們發(fā)現(xiàn)同對(duì)照細(xì)胞株和174A穩(wěn)轉(zhuǎn)株相比,174E穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線變慢。用nocodazole阻滯上述A375穩(wěn)轉(zhuǎn)株于G2/M期,然后分別釋放,我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)174E的細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)展明顯加快,而174A細(xì)胞株的細(xì)胞周期進(jìn)展顯著減緩,這說(shuō)明PAK1Ser174位點(diǎn)的磷酸化的精確調(diào)控對(duì)于維持正常的細(xì)胞周期

9、進(jìn)展以及細(xì)胞的生長(zhǎng)不可或缺。我們的實(shí)驗(yàn)也提示了PAK1可作為CDK11p58M期特異的效應(yīng)分子發(fā)揮作用。這將使我們對(duì)CDK11p5g和PAK1激酶的功能以及二者之間的聯(lián)系有進(jìn)一步認(rèn)識(shí),有助于了解真核細(xì)胞M期調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 為進(jìn)一步研究CDK11家族成員與PAK1之間的關(guān)系,需要獲得大量具有生物學(xué)活性的和近似于體內(nèi)修飾的蛋白。我們應(yīng)用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),首先體外構(gòu)建了重組的表達(dá)His-CDK11p46和His-PAK1的