Rho蛋白激酶調(diào)控Ezrin磷酸化水平干預(yù)肝癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率及死亡率高，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大。在我國(guó)，肝癌的發(fā)病率和死亡率在所有的惡性腫瘤中排名第三，占全世界肝癌患者的42.5％。目前對(duì)于肝癌的治療策略和長(zhǎng)期療效仍不甚理想。其在肝組織內(nèi)的高復(fù)發(fā)率和癌組織向遠(yuǎn)處組織的高轉(zhuǎn)移率是導(dǎo)致其治愈率低的主要原因。因此，深入揭示肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，闡明肝癌細(xì)胞惡性變的關(guān)鍵基因和

2、蛋白表達(dá)，對(duì)于戰(zhàn)勝這一臨床頑疾具有極其重要的科學(xué)意義。
　　在肝癌的進(jìn)展過程中，多種蛋白的表達(dá)的改變參與了肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。Ezrin（埃茲蛋白）是細(xì)胞膜上一類典型的膜-骨架連結(jié)蛋白，對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架相互作用的調(diào)節(jié)具有重要意義，有研究表明，Ezrin的表達(dá)及磷酸化水平與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，探討Ezrin的表達(dá)及磷酸化調(diào)控與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力之間的關(guān)系。
　

3、　方法與結(jié)果：
　　首先，通過收集第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽胰脾外科臨床肝癌手術(shù)中的肝癌原發(fā)組織及門脈轉(zhuǎn)移癌栓組織的病理標(biāo)本，進(jìn)行病理學(xué)、組織化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究，我們比較了肝癌原發(fā)組織與門靜脈轉(zhuǎn)移癌栓中Ezrin蛋白磷酸化水平的差異，結(jié)果顯示，在門靜脈轉(zhuǎn)移癌栓中有大量的Ezrin發(fā)生了567位點(diǎn)蘇氨酸（Threonine,Thr）的磷酸化，原位癌中僅有少量Ezrin發(fā)生了Thr567的磷酸化，而在正常組織中則沒有檢測(cè)到發(fā)生Thr5

4、67酸磷酸化的Ezrin，這提示EzrinThr567的磷酸化水平可能與肝癌的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。
　　在此基礎(chǔ)上，我們用模擬Thr567不可磷酸化的突變體CFP-Ezrin567A及模擬567位磷酸化的突變體CFP-Ezrin567D轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，觀察肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Ezrin的磷酸化水平升高，HepG2的遷移能力隨之提高。通過使用Rho激酶的特異性抑制劑Y27632抑制ROCK的活性，并通過R

5、OCKsiRNA特異性抑制ROCK的表達(dá)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)移的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ROCK的活性被抑制，表達(dá)下調(diào)之后，EzrinThr567磷酸化水平降低，肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力隨之下降。
　　為了驗(yàn)證體內(nèi)EzrinThr567磷酸化水平對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移能力的影響，我們通過使用EzrinThr567不同表達(dá)水平的腺病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MHCC97-H肝癌細(xì)胞系，包括CFP對(duì)照組、ezrin野生型、不可磷酸化EzrinT567A及磷

6、酸化EzrinT567D組，并進(jìn)行裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于野生型和CFP對(duì)照組，EzrinThr567D的磷酸化促進(jìn)了肝癌細(xì)胞在裸鼠肝臟內(nèi)的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)伴隨肝癌轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的EzrinThr567的磷酸化，在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系中，可檢測(cè)到的顯著區(qū)別于低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系的EzrinThr567的磷酸化的發(fā)生。EzrinThr567的磷酸化能引起細(xì)胞骨架重排，刺激細(xì)胞膜
　　產(chǎn)生皺褶，促進(jìn)了H

7、epG2細(xì)胞的遷移。因而可以將EzrinThr567的磷酸化水平作為診斷肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的標(biāo)志。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，在肝癌轉(zhuǎn)移中相伴發(fā)生的EzrinThr567的磷酸化受Rho激酶（ROCK）的調(diào)控，敲除該激酶或者抑制其活性均可以減少肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生；另外，外源引入的EzrinThr567不可磷酸化的突變體EzrinT567A也可以競(jìng)爭(zhēng)性的降低肝癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　因此，我們?cè)O(shè)想Ezrin可以作為未來抑制肝癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，并可以通過抑制