P21活化的蛋白激酶2通過(guò)磷酸化原癌基因蛋白c-Jun促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察P21活化的蛋白激酶2(PAK2)磷酸化原癌基因蛋白c-Jun對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的影響，闡明PAK2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，探討PAK2作為腫瘤治療新靶點(diǎn)的可能性，為惡性腫瘤治療提供新的思路和方法。
　　 方法：
　　 1.利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平。
　　 2.利用sh-RNA技術(shù)使小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)以及人黑色素瘤SK-ME

2、L-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降(knockdown)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)化和AP-1活性的影響。
　　 3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察不同處理因素條件下對(duì)細(xì)胞增值的影響。
　　 4.Soft-agar克隆實(shí)驗(yàn)(anchorage-independent cell transformation assay)分析小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)，人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降(knockdown)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響；小鼠

3、上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)被突變的c-Jun質(zhì)粒(pcDNA4-mut-C-Jun)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。
　　 5.轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用AP-1活性檢測(cè)方法觀察小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)，人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的影響；JB6細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)被突

4、變的c-Jun質(zhì)粒(pcDNA4-mut-c-Jun)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的影響；JB6細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PAK2和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)，pcDNA3.1-PAK2和五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)被突變的c-Jun質(zhì)粒(pcDNA4-mut-c-Jun)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性的影響。
　　 6.應(yīng)用哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)(Mammalian two-hybri

5、d assay)觀察PAK2和c-Jun是否能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。
　　 7.體外PAK2激酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(PAK2 kinase assay)觀察有活性的PAK2激酶是否能結(jié)合并磷酸化全長(zhǎng)的c-Jun蛋白；觀察有活性的PAK2激酶磷酸化全長(zhǎng)的c-Jun蛋白是在絲氨酸位點(diǎn)還是蘇氨酸位點(diǎn)。
　　 8.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Immunoprecipitation)觀察外源性的PAK2和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)是

6、否能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。
　　 9.c-Jun肽段圖分析(c-Jun piptides mapping)檢測(cè)c-Jun蛋白能夠被PAK2磷酸化的蘇氨酸位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平結(jié)果：
　　 ①表皮生長(zhǎng)因子EGF能活化PAK2，在EGF(10ng/ml)處理15分鐘后后，能看到PAK2被活化，隨著EGF刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，PAK2的磷酸化水平顯示出逐

7、漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，在EGF刺激3小時(shí)后PAK2出現(xiàn)最強(qiáng)的磷酸化活性。同時(shí)，由EGF誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化作為一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。
　　 ②在穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞系中用EGF(10ng/ml)于不同時(shí)間點(diǎn)刺激條件下檢測(cè)了一些蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組sh-mock相比，在PAK2表達(dá)下降穩(wěn)定細(xì)胞系中，所有被檢測(cè)的蛋白表達(dá)水平(p-ERK1/2，ERK1/2，p-RSK，RSK，p-c-Jun(Ser6

8、3)，pr-c-Jun(Ser73)，c-Jun，c-Fos)都沒(méi)有改變。
　　 ③在J86細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)質(zhì)粒和五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)被突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)質(zhì)粒，建立穩(wěn)定細(xì)胞系，在穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)和五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(p

9、cDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞中，我們檢測(cè)到xpress標(biāo)簽以證實(shí)pcDNA4-wt-c-Jun和pcDNA4-mut-c-Jun已被成功的轉(zhuǎn)染入JB6細(xì)胞。
　　 ④在小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞，人皮膚角質(zhì)Hacat細(xì)胞，人黑色素瘤SK-MEL-5和SK-MEL-28細(xì)胞中檢測(cè)了PAK2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示出PAK2在人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEK-5和SK-MEK-28中是高表達(dá)的。
　　 2.利用s

10、h-RNA技術(shù)使小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞內(nèi)以及黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞內(nèi)PAK2表達(dá)下降(knockdown)的結(jié)果。
　　 ①在JB6細(xì)胞中感染sh-PAK2病毒載體建立穩(wěn)定細(xì)胞系，阻滯了90％的內(nèi)源性的PAK2蛋白的表達(dá)。
　　 ②在人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞中感染sh-PAK2病毒載體建立穩(wěn)定細(xì)胞系，阻滯了大約80％的內(nèi)源性的PAK2蛋白的表達(dá)。
　　 3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 ①比

11、較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞的增殖曲線，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的JB6細(xì)胞的增殖明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的JB6細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
　　 ②比較穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞的增殖曲線，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T

12、8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞的增殖明顯低于穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
　　 ③比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞的增殖曲線，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5細(xì)胞的增殖明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL

13、-5細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
　　 4.Soft-agar克隆實(shí)驗(yàn)(anchorage-independent cell transformationassay)結(jié)果。
　　 ①比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞在soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的JB6細(xì)胞在soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)明顯的少于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的JB6細(xì)胞在soft-agar中產(chǎn)生的克

14、隆數(shù)(P<0.05)。
　　 ②比較穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)明顯

15、的少于穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)(P<0.05)。
　　 ③比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5細(xì)胞在Soft-agar中產(chǎn)生的克隆數(shù)明顯的少于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞在Soft-aga

16、r中產(chǎn)生的克隆數(shù)(P<0.05)。
　　 5.轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性(AP-1 activity)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
　　 ①比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的JB6細(xì)胞的AP-1活性，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的JB6細(xì)胞AP-1活性明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的JB6細(xì)胞(P<0.05)。
　　 ②比較穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-

17、mut-c-Jun)和野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞的AP-1活性，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)的JB6細(xì)胞AP-1活性明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)的JB6細(xì)胞(P<0.05)。
　　 ③比較穩(wěn)定表達(dá)sh-mock和sh-PAK2的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)

18、胞的AP-1活性，結(jié)果顯示出穩(wěn)定表達(dá)sh-PAK2的人黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-5細(xì)胞AP-1活性明顯的低于穩(wěn)定表達(dá)sh-mock的人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞(P<0.05)。
　　 ④.當(dāng)野生型c-Jun(pcDNA4-wt-c-Jun)和pcDNA3-1-PAK2質(zhì)粒被共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入JB6細(xì)胞時(shí)，與其它轉(zhuǎn)染組相比，AP-1的活性明顯的升高(p<0.05)。然而，當(dāng)五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)

19、突變的c-Jun(pcDNA4-mut-c-Jun)和pcDNA3.1-PAK2質(zhì)粒被共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入JB6細(xì)胞時(shí)，與pcDNA3.1-PAK2和pcDNA4-wt-c-Jun共轉(zhuǎn)染組相比，AP-1的活性顯著降低(p<0.05)。
　　 6.哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)(Mammalian two-hybrid assay)結(jié)果顯示PAK2和c-jun能夠在HEK293細(xì)胞中結(jié)合，當(dāng)pBIND-PAK2和pACT-c-Jun共轉(zhuǎn)染時(shí)，其lu

20、ciferase的活性大約是對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染pG5lu)的35倍高；pBIND-PAK2和pACT-c-Jun共轉(zhuǎn)染組作為陽(yáng)性對(duì)照，其luciferase的活性大約是對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染pG5lu)的65倍高。
　　 7.體外激酶活性檢測(cè)(PAK2 kinase assay)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　 ①.PAK2能夠在細(xì)胞外結(jié)合并磷酸化c-Jun.
　　 ②.PAK2能夠在蘇氨酸位點(diǎn)強(qiáng)烈的磷酸化c-Jun，而不能在絲氨酸位點(diǎn)

21、磷酸化c-Jun，包括兩個(gè)著名的位點(diǎn)絲氨酸63(Ser63)和絲氨酸73(Ser73)。
　　 8.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Immunoprecipitation)結(jié)果顯示：外源性的PAK2和野生型c-Jun轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，V5標(biāo)簽的PAK2被V5抗體結(jié)合并被beads共沉淀，c-Jun蛋白能夠隨著PAK2的沉淀被免疫共沉淀，這說(shuō)明PAK2和c-Jun在細(xì)胞內(nèi)能夠結(jié)合。
　　 9.c-Jun肽段圖(c-Jun piptides ma

22、pping)分析檢測(cè)結(jié)果：
　　 ①.T2，T8，T89，T93，T286五個(gè)位點(diǎn)信號(hào)較強(qiáng)，T91，T126，T231三個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有信號(hào)，表明PAK2磷酸化c-jun在五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)。
　　 ②.有活性的PAK2激酶與不同位點(diǎn)突變的全長(zhǎng)的c-Jun蛋白在細(xì)胞外反應(yīng)顯示，只有五個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變(T2，T8，T89，T93，T286)，PAK2才不能磷酸化c-Jun。
　　 結(jié)論：

23、
　　 1.在小鼠上皮JB6 C141細(xì)胞中及人黑色素瘤SK-MEL-5細(xì)胞中感染(infect)sh-PAK2病毒載體，建立穩(wěn)定細(xì)胞系，使PAK2表達(dá)下降，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，同時(shí)AP-1活性下降。
　　 2.c-Jun的五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T93，T286)同時(shí)突變后，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，同時(shí)AP-1活性下降。
　　 3.PAK2能結(jié)合并磷酸化c-Jun在五個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T2，T8，T89，T