TOPK磷酸化c-Jun促進EGFR-TKIs耐藥肺癌細胞生長的分子機制研究.pdf

1、肺癌是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病，也是全球癌癥相關(guān)性死亡的首要原因，其中NSCLC約占85％。當(dāng)前，表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）在NSCLC治療方面獲得了巨大的成功，已發(fā)展成為肺癌治療的一線藥物。盡管如此，臨床中大部分EGFR突變陽性患者經(jīng)過一段時間的治療后對EGFR-TKIs產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，因此對EGFR-TKIs獲得性耐藥機制及其臨床應(yīng)對策略的研究成為靶向治療領(lǐng)域的又一研究熱點。現(xiàn)有研究表明，非小細胞

2、肺癌EGFR-TKIs獲得性耐藥機制主要表現(xiàn)為細胞繞過EGFR直接通過其下游分子來激活肺癌細胞生長的信號通路。因此，越來越多的研究者開始關(guān)注EGFR信號通路的下游分子以及與肺癌生長密切相關(guān)的一些蛋白激酶，以克服EGFR-TKIs的耐藥問題。
　　TOPK是一種由322個氨基酸構(gòu)成的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，首次發(fā)現(xiàn)于淋巴因子激活的殺傷性 T細胞。以往研究表明，TOPK與有絲分裂期間紡錘體的功能密切相關(guān)，TOPK的敲除將導(dǎo)致細胞胞質(zhì)分

3、裂的推遲。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TOPK在多種腫瘤細胞中呈強表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TOPK與細胞內(nèi)多個凋亡相關(guān)蛋白的活化和表達有關(guān)，參與調(diào)控細胞的凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定干涉TOPK表達后，可以對細胞內(nèi)的一些凋亡相關(guān)蛋白以及細胞周期蛋白的表達水平產(chǎn)生不同程度的影響，提示TOPK可能在癌癥耐藥過程中具有重要的作用。AP-1是一個二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，包含可以與DNA結(jié)合的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。Jun（c-Jun，JunB和JunD）和Fos

4、（Fos，F(xiàn)osB，F(xiàn)ra-1，F(xiàn)ra2）亞家族是主要的AP-1蛋白。現(xiàn)有證據(jù)表明，AP-1在腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮了重要作用。c-Jun是癌基因，c-Jun活化后可以調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而參與細胞的生長、分化和凋亡等多種生理過程。c-Jun的調(diào)節(jié)與AP-1的轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。但c-Jun已知最主要的調(diào)節(jié)蛋白是 JNK（c-Jun amino-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)。JNK是絲裂原激活的蛋白激酶超

5、家族成員，JNK接受上游信號后被激活，從而與c-Jun結(jié)合并且磷酸化2個絲氨酸/蘇氨酸叢，Ser63/73和Thr91/93，進而激活c-Jun增強其轉(zhuǎn)錄活性。c-Jun磷酸化后轉(zhuǎn)錄活性增強，蛋白的半衰期顯著延長。但是JNK只在各種應(yīng)激狀態(tài)下被激活，其中最有效的方式是導(dǎo)致DNA損傷的UV刺激。然而在腫瘤正常生長狀態(tài)下不存在UV刺激，JNK的活化水平較低，那么尋找肺癌細胞中新的能夠活化c-Jun進而調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性的蛋白激酶是肺癌研究

6、的關(guān)鍵。眾所周知，肺癌細胞能夠大量自分泌EGF，促進腫瘤細胞的生長。腫瘤細胞在EGF刺激下不能活化JNK，但可以活化TOPK，并呈劑量依賴性，這就使得EGFR-TKIs耐藥肺癌細胞通過TOPK-c-Jun-AP-1通路促進腫瘤細胞生長成為可能。
　　目的：
　　①確立TOPK在EGFR-TKIs耐藥肺癌細胞生長中的重要作用；
　　②闡明TOPK通過磷酸化c-Jun進而促進AP-1轉(zhuǎn)錄活性的具體分子機制。
　　方法

7、和結(jié)果：
　?、偈紫炔捎媒M織芯片技術(shù)和western blot方法分別在肺癌患者組織和肺癌細胞系中檢測了TOPK的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EGFR-TKIs耐藥的肺癌患者和肺癌細胞株中都存在TOPK高表達現(xiàn)象。接下來采用慢病毒干涉技術(shù)建立了A549 shMOCK和A549 shTOPK穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，進一步利用CCK8技術(shù)和軟瓊脂克隆形成實驗觀察干涉TOPK表達對A549 shMOCK和A549 shTOPK細胞生長以及對吉非替尼敏感性的

8、影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EGFR-TKIs耐藥的A549細胞中下調(diào)TOPK的表達可以明顯抑制它的增殖和克隆形成能力，并且顯著提高它對于吉非替尼的敏感性。而在吉非替尼敏感的肺癌細胞株H358中提高TOPK的表達后，該細胞對吉非替尼的敏感性下降。
　?、诓捎脀estern blot方法檢測了EGFR-TKIs耐藥肺癌細胞A549和敏感肺癌細胞H358中TOPK及相關(guān)底物的蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TOPK活化水平與c-Jun磷酸化表達水平呈正相

9、關(guān)。進一步采用同源建模預(yù)測發(fā)現(xiàn)TOPK可以和c-Jun相互結(jié)合。
　　③通過哺乳動物雙雜交系統(tǒng)證明了TOPK與c-Jun存在相互作用。采用免疫共沉淀方法分別在外源性表達TOPK和c-Jun的HEK293細胞和內(nèi)源性表達的A549細胞中證實了TOPK與c-Jun存在相互作用。進一步利用體外激酶技術(shù)發(fā)現(xiàn)TOPK對c-Jun全長蛋白具有磷酸化作用。并且通過點突變分析證明TOPK磷酸化c-Jun的氨基酸位點為Ser63和Ser73。且利用

10、一系列western blot實驗證實了TOPK對c-Jun的磷酸化作用。
　?、懿捎肁P-1 luciferase報告質(zhì)粒技術(shù)，觀察TOPK磷酸化c-Jun對AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TOPK磷酸化c-Jun可以顯著提高AP-1的轉(zhuǎn)錄活性。并采用real timePCR和western blot技術(shù)檢測AP-1靶基因CCND1和CDC2 mRNA水平和蛋白水平的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TOPK的表達水平與CCND1和CDC2 mRN

11、A和蛋白的表達水平呈正相關(guān)。
　?、莶捎寐闶笠浦擦瞿Ｐ?，觀察在體內(nèi)TOPK表達對肺癌細胞A549吉非替尼耐藥性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549 shTOPK組腫瘤生長速度明顯低于A549 shMOCK組，并且A549 shTOPK組對吉非替尼的敏感性顯著高于A549 shMOCK組。并利用western blot方法檢測各組移植瘤中TOPK、c-Jun及其磷酸化蛋白的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)TOPK的表達能夠明顯降低c-Jun的磷酸化水平。

12、
　　結(jié)論：
　　通過本課題的研究，我們發(fā)現(xiàn)了TOPK在EGFR-TKIs耐藥肺癌細胞生長中發(fā)揮了重要作用，并闡明了其作用機制。首先，我們發(fā)現(xiàn)TOPK在EGFR-TKIs耐藥肺癌細胞中高表達，能促進肺癌細胞的生長，并與肺癌細胞EGFR-TKIs耐藥性相關(guān)；其次，發(fā)現(xiàn)TOPK與c-Jun存在相互作用，TOPK通過磷酸化c-Jun第63、73位絲氨酸而活化c-Jun；最后，我們發(fā)現(xiàn)TOPK活化c-Jun可以提高轉(zhuǎn)錄因子AP-1的