uPA通過(guò)TEM8誘導(dǎo)EGFR磷酸化的研究.pdf

1、近年來(lái)，靶向破壞腫瘤脈管系統(tǒng)在腫瘤生物學(xué)和治療學(xué)領(lǐng)域上受到眾多研究人員的關(guān)注。腫瘤血管化提供腫瘤持續(xù)的發(fā)生發(fā)展所必需的氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)腫瘤通過(guò)血管獲得潛在的遷移能力，并且由此能夠緩解其無(wú)限增殖導(dǎo)致的低氧環(huán)境。血管發(fā)生則是促血管生成蛋白的產(chǎn)生導(dǎo)致現(xiàn)存的脈管萌發(fā)并在循環(huán)回復(fù)中使內(nèi)皮細(xì)胞形成新的脈管網(wǎng)絡(luò)。若這種血管發(fā)生受到抑制或改變，腫瘤則無(wú)法從新生脈管系統(tǒng)中得到營(yíng)養(yǎng)的供給，那么這些腫瘤組織將會(huì)饑餓而死。于是，靶向脈管生成而治療腫瘤的發(fā)生發(fā)

2、展顯得尤為重要。同時(shí)這些脈管網(wǎng)絡(luò)受腫瘤微環(huán)境影響，導(dǎo)致多種蛋白表達(dá)改變。經(jīng)過(guò)一系列的分子技術(shù)探究得到一些集中過(guò)表達(dá)的蛋白，其中較為特別的就是腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物8(TEM8)，其在多種腫瘤血管中高表達(dá)。
　　TEM8是Ⅰ型跨膜蛋白，在胚胎細(xì)胞及腫瘤脈管系統(tǒng)中高表達(dá)，并且在種間高度保守，能夠促進(jìn)腫瘤相關(guān)的血管生成，并作為PA（炭疽毒素保護(hù)性抗原）的受體介導(dǎo)炭疽毒素進(jìn)入宿主細(xì)胞，但其確切的生理功能還未能明確。一些研究發(fā)現(xiàn)，TEM8促進(jìn)腫瘤細(xì)

3、胞的遷移和粘附，并在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。在體外研究中得知，TEM8在多種內(nèi)皮細(xì)胞的功能中具有重要作用，其胞外區(qū)能夠結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，同樣也能夠結(jié)合炭疽毒素保護(hù)性抗原。在臨床樣本及研究中均顯示TEM8在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而在正常成熟組織中，TEM8的表達(dá)零星不規(guī)則并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于腫瘤內(nèi)皮組織。這些發(fā)現(xiàn)均暗示了在成熟細(xì)胞內(nèi)TEM8高表達(dá)往往是由于異常的脈管生成，如腫瘤脈管系統(tǒng)，所以可以將TEM8作為靶向腫瘤內(nèi)皮組織的治療靶點(diǎn)。<

4、br>　　TEM8具有三種天然突變體，其中IsoformⅠ具有563個(gè)氨基酸殘基，包括320個(gè)氨基酸的胞外區(qū)、23個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)以及221個(gè)氨基酸殘基的胞內(nèi)區(qū)。其胞內(nèi)區(qū)具有14個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)以及一個(gè)富含脯氨酸的C端胞質(zhì)區(qū)。其中TEM8的胞外區(qū)主要由包含一個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)(MIDAS)的vWA結(jié)構(gòu)域組成，同時(shí)也是TEM8胞外蛋白質(zhì)間相互作用的區(qū)域，其與integrin（整聯(lián)蛋白）的1結(jié)構(gòu)域具有很高的同源性，故推測(cè)其生理功能可能與i

5、ntegrin相似。有報(bào)道稱(chēng)uPA能夠通過(guò)結(jié)合integrin、EGFR等促使細(xì)胞遷移粘附及增殖。
　　本課題組在前期工作中，構(gòu)建并表達(dá)了一種抗體樣分子——TEM8-Fc(TEM8胞外區(qū)的vWA結(jié)構(gòu)域和IgG1 Fc段組成的融合蛋白)，發(fā)現(xiàn)其具有抗血管生成能力，并能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及血管生成，然而其抗腫瘤機(jī)制并不十分清楚。在實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)得到TEM8新的生理性配體——uPA，并證明其與TEM8間

6、具有一定的相互作用，同時(shí)TEM8在動(dòng)物模型中具有一定的抗腫瘤作用。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)想uPA與TEM8及EGFR可以發(fā)生相互作用，導(dǎo)致EGFR磷酸化并激活下游信號(hào)通路，故可將TEM8作為抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的靶點(diǎn)。
　　為了驗(yàn)證TEM8能夠結(jié)合uPA、EGFR并實(shí)現(xiàn)其相應(yīng)的生理功能，首先進(jìn)行TEM8-Fc蛋白的制備，并進(jìn)一步進(jìn)行ELISA、基因沉默、免疫沉淀、流式細(xì)胞分析等實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作，說(shuō)明uPA與TEM8具有一定的相互作用。流式

7、細(xì)胞分析結(jié)果表明野生型CHO-K1能夠結(jié)合PE標(biāo)記的uPA，而TEM8缺陷型CHO-Pr230并不能結(jié)合uPA，說(shuō)明uPA結(jié)合至CHO細(xì)胞表面依賴(lài)于TEM8的表達(dá)?；虺聊瑢?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HepG2和CHO細(xì)胞中TEM8蛋白沉默大大降低了細(xì)胞對(duì)uPA的結(jié)合能力，從而說(shuō)明TEM8可作為uPA除uPAR外的另一個(gè)受體。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明TEM8與uPA之間具有一定的相互作用，且具有劑量依賴(lài)性。用純化的TEM8-Fc蛋白與uPA之間進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性

8、ELISA，結(jié)果顯示uPA與TEM8結(jié)合力較強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)為1×107。同時(shí)，在uPA刺激下進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示uPA刺激下TEM8與EGFR發(fā)生共定位現(xiàn)象，說(shuō)明uPA能夠促進(jìn)TEM8與EGFR間相互作用。
　　在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)EGFR磷酸化進(jìn)行研究。在EGF、uPA的刺激下，探索EGFR的磷酸化位點(diǎn)及磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)室前期磷酸化芯片結(jié)果顯示，uPA能夠使EGFR Y1173位、Y845位磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平上調(diào)。為了了

9、解uPA刺激下EGFR的磷酸化中TEM8的作用，首先在TEM8、EGFR高表達(dá)的細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中研究EGF、uPA刺激下EGFR的磷酸化作用。綜合對(duì)EGFR Y845、Y992、 Y1045、Y1068、Y1086、Y1173等磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平研究，磷酸化WB結(jié)果證明uPA能夠上調(diào)EGFR Y1173、Y845位的磷酸化水平，尤其顯著上調(diào)Y845位磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明uPA能夠增強(qiáng)EGFR的磷酸化作用。其次，構(gòu)建TEM8、EGF

10、R過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，選取TEM8、EGFR均低表達(dá)的HEK293F細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染得到TEM8/EGFR共表達(dá)的細(xì)胞系TEM8-EGFR/HEK293F，通過(guò)對(duì)TEM8-EGFR/HEK293F與EGFR/HEK293F細(xì)胞系EGFR磷酸化水平的比較，以此確定TEM8在uPA刺激EGFR磷酸化中的促進(jìn)作用。
　　在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在uPA、EGF的刺激下，TEM8有入核現(xiàn)象，即刺激致使TEM8蛋白進(jìn)入核內(nèi)發(fā)生一定的生理作用。為探索TEM

11、8入核是否為其正常生理功能，以及入核實(shí)現(xiàn)何種生理功能，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。免疫熒光層掃實(shí)驗(yàn)證明，在EGF刺激10min、uPA刺激15 min后TEM8有明顯的入核現(xiàn)象。為進(jìn)一步確定其入核，我們將TEM8高表達(dá)的HepG2細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)分離，實(shí)驗(yàn)證明EGF、uPA的刺激能夠明顯提高TEM8在細(xì)胞核內(nèi)的含量，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)中TEM8的含量相應(yīng)減少，提示刺激發(fā)生后TEM8可能有入核現(xiàn)象。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TEM8作為integrin類(lèi)