小鼠肝臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法構(gòu)建與HBx通過調(diào)控PDK1磷酸化參與HCC發(fā)生.pdf

1、磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，調(diào)節(jié)著細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、新陳代謝等生物學(xué)過程，但由于蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞內(nèi)的低化學(xué)計(jì)量、不均一性以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制，許多磷酸化現(xiàn)象還未得以發(fā)現(xiàn)。近年由于質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，結(jié)合磷酸化肽段富集技術(shù)使得對磷酸化進(jìn)行大規(guī)模鑒定成為可能，結(jié)合生物信息分析，可以獲得全面的磷酸化蛋白質(zhì)組的信息，為細(xì)胞基本生命活動分子機(jī)制、疾病發(fā)生機(jī)制及和藥物靶點(diǎn)等多方面研究提供一個有力的平臺。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是一

2、種高通量蛋白分離和質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的磷酸化蛋白鑒定的學(xué)科，通過對于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，來發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的分子標(biāo)志物、診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)、數(shù)目及其動態(tài)變化的鑒定具有十分重要的意義。
　　磷酸化修飾起到廣泛的調(diào)節(jié)作用，很多疾病的發(fā)生都是由磷酸化修飾的異常而導(dǎo)致的，蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是由蛋白激酶、磷酸結(jié)合蛋白、磷酸酶三個部分組成。蛋白激酶是其中重要的調(diào)節(jié)因子，很多疾病的發(fā)生與磷酸化修飾的失調(diào)和磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的紊

3、亂有關(guān)[2]，蛋白激酶中每一個磷酸化位點(diǎn)的修飾都具有重要的生物學(xué)意義，磷酸化修飾通過改變蛋白的構(gòu)象改變和蛋白與蛋白之間的相互作用而起到功能調(diào)節(jié)的作用。
　　HBV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，由編碼外殼蛋白的S區(qū)、編碼核心蛋白的C區(qū)、編碼聚合酶的P區(qū)以及X區(qū)四部分組成。HBx是HBV開放閱讀塊X區(qū)編碼的的蛋白，蛋白質(zhì)分子量為17kD，由154個氨基酸組成，HBx是在哺乳動物中高度保守的區(qū)域。肝細(xì)胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率

4、第二位，嚴(yán)重威脅著人們的健康。在我國80％肝細(xì)胞癌的發(fā)生與HBV的感染相關(guān)，HBx保守的存在于病毒DNA中，而且有一些研究認(rèn)為在沒有HBV復(fù)制的情況下，HBx仍表達(dá)于肝細(xì)胞癌細(xì)胞中[3]。HBx廣泛的參與細(xì)胞的生物學(xué)過程，起到轉(zhuǎn)錄激活作用、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)的作用，在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，起到促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的作用，因此HBx被認(rèn)為是與HCC發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)蛋白。
　　文章的第一章我們構(gòu)

5、建了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對正常小鼠的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了收集和分析，并對該方法進(jìn)行了評估。我們對小鼠肝臟進(jìn)行FASP酶切，再利用TiO2對于酶切后的肽段進(jìn)行富集，我們對酶切后的肽段進(jìn)行分離，以提高TiO2富集磷酸化肽時的效率，最后對富集后的磷酸化肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析。利用該方法，我們鑒定到了1271個磷酸化蛋白、5386磷酸化位點(diǎn)和4553磷酸化肽段，并對鑒定到的磷酸化修飾蛋白進(jìn)行GO分析、Motif分析、激酶分類、新鑒定到的激酶

6、磷酸化位點(diǎn)的分析。蛋白激酶抑制劑在癌癥治療時也是主要和高效的藥物，文章中對于新的激酶位點(diǎn)的挖掘，可以為蛋白激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供有價值的信息，也為探討和研究磷酸化修飾蛋白在肝臟生理病理過程中發(fā)揮的重要作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　在文章的第二章中，我們首次對HBx轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠肝臟和正常小鼠肝臟進(jìn)行大規(guī)模高通量的差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并且得到了差異的磷酸化蛋白的數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步的挖掘和分析。在我們的研究中，利用HBx基因

7、定點(diǎn)插入的小鼠模型，并且生長到24個月的時候HBx基因型的小鼠形成了肝細(xì)胞癌，通過病理切片和RT-PCR的檢測，我們確認(rèn)小鼠模型構(gòu)建成功。利用該模型，我們對24月齡的HBx基因型小鼠和野生型小鼠進(jìn)行了基于SILAC的磷酸化蛋白質(zhì)組差異分析。利用HBx基因定點(diǎn)插入的24月齡小鼠肝癌模型和24月齡野生型小鼠模型的差異磷酸化蛋白質(zhì)組的比較，我們發(fā)現(xiàn)了功能重要的PDK1和WNK1兩個激酶。在我們鑒定到數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)在HBx組PDK1和WNK1的磷酸

8、化水平發(fā)生明顯的上調(diào)，所以我們重點(diǎn)關(guān)注了這兩個激酶與HBx的關(guān)系，并且構(gòu)建了HBx瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株來進(jìn)一步闡述HBx對于PDK1的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)在HBx過表達(dá)的細(xì)胞系中，p-PDK1發(fā)生明顯的上調(diào)，同時p-WNK1的磷酸化也發(fā)生明顯的上調(diào)。根據(jù)目前已有的研究，我們知道PDK1參與調(diào)控細(xì)胞增殖，當(dāng)我們用PI3K和PDK1的激酶抑制劑處理細(xì)胞時，細(xì)胞增殖會被有效抑制，然而在穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞中，PI3K和PDK1的抑制劑的效果會減弱，

9、并且p-PDK1和p-WNK1會有劑量依賴性的下調(diào)，所以可以得出結(jié)論，HBx能夠有效抑制PI3K和PDK1抑制劑的抑制增殖的作用，并且很有可能是通過PDK1/WNK1這條通路來發(fā)揮抑制增殖作用的。在HBV相關(guān)的HCC的臨床樣本中，我們對我們的假設(shè)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在HBV陽性的HCC中，相比于癌旁組織p-PDK1發(fā)生了顯著的上調(diào)。
　　我們利用差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對肝癌小鼠和正常小鼠進(jìn)行了組學(xué)分析，并對得到的差異蛋白進(jìn)行