磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的理論研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)調(diào)節(jié)方式，幾乎涉及所有的生理及病理過程，如糖代謝、細(xì)胞的生長發(fā)育、基因表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，甚至癌變等，在信號傳導(dǎo)過程中占有極其重要的地位。信號傳導(dǎo)是維系外部刺激與細(xì)胞反應(yīng)的橋梁。蛋白質(zhì)在體內(nèi)可逆的磷酸化和去磷酸化過程通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化或蛋白之間相互作用，對生理過程起到類似“開關(guān)”的調(diào)節(jié)作用。
　　從20世紀(jì)90年代以來，隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，生物信息學(xué)得到了迅猛

2、的發(fā)展，而蛋白質(zhì)作為生物信息學(xué)研究的一個(gè)重要對象，有關(guān)蛋白質(zhì)的理論模擬已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。應(yīng)用分子模擬的方法構(gòu)建蛋白質(zhì)三維模型，研究生物大分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分析蛋白質(zhì)與底物相互作用，描述蛋白質(zhì)的生化機(jī)理已經(jīng)成為進(jìn)行生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)主要手段。除了常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬外，近年發(fā)展起來的拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬通過引入外加力(勢場)和減少蛋白質(zhì)構(gòu)象空間自由度等策略，使分子動(dòng)力學(xué)應(yīng)用范圍更廣。自由能計(jì)算方法為蛋白質(zhì)構(gòu)象變化提供定量的描述，對

3、反應(yīng)發(fā)生的路線和機(jī)理提供依據(jù)。
　　本論文選取兩個(gè)磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和功能的體系作為研究對象，通過常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬、拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能計(jì)算三種方法相結(jié)合的手段，研究在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化以后，對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化以及蛋白質(zhì)之間結(jié)合情況帶來的影響，及調(diào)控蛋白功能的分子機(jī)制。
　　1.Set88位磷酸化調(diào)控LC8解離機(jī)理的理論研究
　　動(dòng)力蛋白輕鏈?zhǔn)且活愋蛄懈叨缺Ｊ氐牡鞍踪|(zhì)，在生理?xiàng)l件下以二聚體形式存在，參

4、與一系列細(xì)胞內(nèi)重要的生理過程。有實(shí)驗(yàn)證明，在細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力蛋白輕鏈LC8的二聚體結(jié)構(gòu)可以被蛋白激酶在Ser88位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致二聚體解離，對哺乳細(xì)胞凋亡過程起到抑制作用。但從生化實(shí)驗(yàn)里面無法得到磷酸化的細(xì)節(jié)和對二聚體結(jié)構(gòu)的影響，以及引起二聚體解離的機(jī)理。我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能計(jì)算相結(jié)合的方法，為磷酸化導(dǎo)致LC8解離的機(jī)理提供了原子尺度的解釋。
　　10ns常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明當(dāng)在Ser88發(fā)生突變或磷酸化(S88E/pS

5、er88)時(shí)，Ser88附近的殘基和一些相互作用受到擾動(dòng)。突變使原本緊密結(jié)合的Ser88和Ser88’由于同性負(fù)電荷的引入而互相排斥，原有的較為牢固的氫鍵作用被打破。同時(shí)，由于位于二聚體結(jié)合界面負(fù)電荷的引入，使蛋白局部極性增加，從而吸引周圍溶劑中的水分子靠近表面，為水分子進(jìn)入疏水結(jié)合界面打開了一個(gè)通道。從模擬的結(jié)果很清晰的看到，在突變體中水分子由C-端Glu88/pS88位置進(jìn)入結(jié)合界面，通過與His55的側(cè)鏈相互作用，干擾圍繞His5

6、5周圍的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。由于His55不再包埋在疏水界面內(nèi)，而是更多的暴露在水環(huán)境中，從而導(dǎo)致其側(cè)鏈pKa值增大，增加它的質(zhì)子化幾率。而以往的研究已經(jīng)表明His55的質(zhì)子化能夠使二聚體結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定性。因此我們的研究表明，LC8在Ser88磷酸化導(dǎo)致二聚體結(jié)構(gòu)解離的過程是通過間接調(diào)節(jié)His55的質(zhì)子化狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)的。
　　自由能計(jì)算給出了由Ser88磷酸化引起二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降的能量數(shù)據(jù)。S88E體系的△△GDisso是-6.6kcal/

7、mol，與實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)果(-8.1kcal/mol)符合的較好。我們的計(jì)算還給出了實(shí)驗(yàn)中難以檢測到的pSer88體系的△△GDisso為-50.8kcal/mol。通過對自由能結(jié)果的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)自由能變化主要是由帶負(fù)電的pSer88靜電排斥作用引起，靜電自由能變化項(xiàng)占主導(dǎo)作用，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合較好。以上結(jié)果都說明，對Ser88進(jìn)行磷酸化確實(shí)會影響LC8二聚體的穩(wěn)定性，使其更易發(fā)生解離。
　　2.磷酸化調(diào)控ZO-1PDZ2與Cx4

8、3結(jié)合機(jī)理的研究
　　ZO-1PDZ2結(jié)構(gòu)域與連接蛋白(Connexin43，Cx43)的相互作用近年來廣受關(guān)注，因?yàn)樗鼈兊南嗷プ饔迷谥T如心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等諸多細(xì)胞中起到調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞間隙聯(lián)結(jié)(Gapjunction，GJ)的位置、移動(dòng)和動(dòng)態(tài)連接模式的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在Cx43靠近C-端的S(-9)位被激酶磷酸化以后，Cx43與ZO-1PDZ2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合被打斷，PDZ2組裝Cx43形成六聚體GJ的功能消失，但是機(jī)理

9、尚不明確。
　　我們采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法對ZO-1PDZ2結(jié)合Cx43體系進(jìn)行系統(tǒng)的研究，共研究了包括FreeFrom(PDZ2未結(jié)合Cx43)、ShortForm(PDZ2結(jié)合Cx43靠近C-端的9個(gè)殘基的肽段體系)、LongForm(PDZ2結(jié)合Cx43靠近C-端的12個(gè)殘基的肽段體系)、LongS(-9)(在LongForm基礎(chǔ)上對S(-9)進(jìn)行磷酸化的體系)和LongS(-9，-10)(在LongForm基礎(chǔ)上同時(shí)對S

10、(-9，-10)進(jìn)行磷酸化的體系)。
　　研究結(jié)果表明，無論是否結(jié)合Cx43肽段以及肽段長短、是否被磷酸化，ZO-1PDZ2二聚體結(jié)構(gòu)都具有較大的柔性，兩個(gè)單體以兩條反平行的β-鏈相互作用的結(jié)合中心為中點(diǎn)，兩個(gè)單體的相對位置在模擬過程中在一定幅度內(nèi)振動(dòng)，單體本身不發(fā)生大的構(gòu)象變化。四個(gè)結(jié)合肽段體系中，Cx43肽段與PDZ2二聚體有不同的結(jié)合強(qiáng)度和結(jié)合模式。通過比較X-ray晶體結(jié)構(gòu)(ZO-1PDZ2結(jié)合9個(gè)氨基酸Cx43肽段體系，

11、ShortForm)和ZO-1PDZ2結(jié)合12個(gè)氨基酸Cx43肽段(LongForm)結(jié)合情況發(fā)現(xiàn)，ShortForm體系中，Cx43肽段N-端脫離于PDZ2表面的結(jié)合，向自身C-端折疊形成發(fā)卡狀構(gòu)象，而LongForm體系中肽段則與PDZ2形成穩(wěn)定的結(jié)合，說明在ShortForm中Cx43的N-端增加的三個(gè)氨基酸ASS對于穩(wěn)定Cx43在PDZ2上的結(jié)合有不可忽略的重要性。對LongForm體系的S(=9)做磷酸化突變，或者同時(shí)磷酸化S