內(nèi)毒素休克小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)征候群，其嚴(yán)重并發(fā)癥——感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)后病人最主要的死亡原因之一。統(tǒng)計(jì)表明，臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的，革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或稱為內(nèi)毒素(endotoxin)，被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機(jī)體

2、多種組織器官，其中內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞，在LPS的刺激下，它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)，進(jìn)而引起失控性的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction，MOD)。因此，膿毒癥或內(nèi)毒素休克(endotoxic shock)的分子機(jī)制的研究大多集中在內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上，而在其它組織和器官上的相對(duì)

3、研究較少。
　　肝臟是人體代謝的樞紐，也是重要的免疫器官，血液中大量蛋白也是由肝臟合成分泌的。在膿毒癥的炎性應(yīng)激刺激下，肝臟可以大量合成并分泌急性期蛋白(acute phaseprotein，AP)，如C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、α1-蛋白酶抑制劑(alpha1-proteinase inhibitor)、結(jié)合珠蛋白(haptoglobin)、纖維蛋白原(fibrinogen)及補(bǔ)體(comple

4、ment)等，可以啟動(dòng)迅速的機(jī)體防御機(jī)制。然而肝臟對(duì)病原微生物或其毒性產(chǎn)物產(chǎn)生什么樣的反應(yīng)？膿毒癥或感染性休克發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中肝臟自身變化如何？肝臟通過什么樣的分子調(diào)控機(jī)制調(diào)控多種炎癥相關(guān)反應(yīng)蛋白的表達(dá)？對(duì)于這些問題，目前所知有限。然而，對(duì)這些問題的解答，對(duì)于了解錯(cuò)綜復(fù)雜的膿毒癥及其感染性休克的發(fā)病機(jī)制無疑是有益的。
　　LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)是內(nèi)毒素致病過程中的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的中心問題就是細(xì)胞感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境刺激及調(diào)節(jié)

5、代謝生理反應(yīng)和基因表達(dá)的分子途徑。磷酸化修飾本身所具有的簡單(simplicity)、靈活(flexibility)、可逆(reversibility)的特性以及磷酸基團(tuán)的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾被真核細(xì)胞所選擇接受成為一種最普遍的調(diào)控手段，蛋白質(zhì)磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所起的無可替代的作用已是人所共知的事實(shí)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)，肌肉收縮，腫瘤發(fā)生等

6、過程在內(nèi)的所有生命活動(dòng)，目前已經(jīng)知道有許多人類疾病是由于異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。那么，內(nèi)毒素休克早期細(xì)胞質(zhì)發(fā)生了哪些功能事件？其具體分子機(jī)制如何？目前所知甚少。因此，進(jìn)行內(nèi)毒素休克時(shí)肝臟細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)研究內(nèi)毒素休克的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是十分重要的。
　　以往的研究大多是在已有的工作基礎(chǔ)上對(duì)少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞分子進(jìn)行分析、在理論上推導(dǎo)出對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的分子，進(jìn)而

7、進(jìn)行深入細(xì)致的功能研究。這是一種傳統(tǒng)的研究策略，其優(yōu)點(diǎn)是研究問題集中，容易深入，可以比較透徹地回答一個(gè)點(diǎn)上的問題，但是若將這個(gè)結(jié)果放到一個(gè)體系層面上，其功能又變得撲簌迷離，這是由“分析”主導(dǎo)的研究手段的局限所導(dǎo)致的，只有當(dāng)這種“點(diǎn)”的結(jié)果積累得足夠多的時(shí)候，體系的問題也會(huì)變得逐漸清晰起來，但這個(gè)過程一般需要長時(shí)間的積累。而蛋白質(zhì)組是高度動(dòng)態(tài)的，即使同一細(xì)胞在不同生理或病理環(huán)境中，其蛋白表達(dá)也是不同的，這種差異蛋白往往是某些疾病發(fā)生的標(biāo)志

8、。利用比較蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，可以批量觀察正常與疾病細(xì)胞（組織）在蛋白質(zhì)表達(dá)譜上的差異，從整體水平上規(guī)?；睾Y選和發(fā)掘潛在的藥物標(biāo)靶，以及適用于早期診斷、介入和治療的疾病蛋白標(biāo)志物。但蛋白的功能僅僅從量的變化上分析往往會(huì)限制我們的研究視野，很多重要蛋白質(zhì)的活性是由翻譯后修飾調(diào)節(jié)的，有時(shí)蛋白水平上看不到明顯變化但翻譯后修飾水平已有顯著變化。因此采用定量技術(shù)對(duì)內(nèi)毒素刺激前后小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行差異定量分析，尋找一批與內(nèi)毒素休克肝

9、損傷的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)的高特異性和靈敏性的生物標(biāo)記物是非常有價(jià)值的。
　　由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，因此可以有效分析細(xì)胞內(nèi)的整體蛋白質(zhì)。然而整個(gè)細(xì)胞或組織的蛋白組成極其復(fù)雜，直接對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，往往會(huì)丟掉很多蛋白質(zhì)信息，由此衍生出了亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)來分析一種組織或細(xì)胞的某一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白質(zhì)組成，它一方面可以降低樣品的復(fù)雜度，使分析簡單化;另一方面可以

10、相對(duì)富集相應(yīng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白，并且可以部分提示蛋白質(zhì)的定位和功能信息。國外已有亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組方面的研究報(bào)道，并向縱深發(fā)展，出現(xiàn)了亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)組和復(fù)合體蛋白質(zhì)組;但目前關(guān)于內(nèi)毒素休克過程中肝臟細(xì)胞質(zhì)蛋白的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究國內(nèi)外未見報(bào)道。
　　熒光差異凝膠電泳(fluorescence differential gel electrophoresis，DIGE)是一種在2-DE電泳之前進(jìn)行熒光染料標(biāo)記蛋白樣品的方法，通過對(duì)不

11、同的蛋白樣品用不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，在同一塊雙向凝膠中可同時(shí)分離多至三種不同的蛋白樣品，并且每塊膠上又引用了內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)的利用進(jìn)一步增加可信度，確保結(jié)果能反映出真實(shí)的生物學(xué)差異，避免了系統(tǒng)誤差實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而能夠?qū)悠烽g蛋白質(zhì)豐度差異進(jìn)行精確分析。DIGE系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是整合了CyDye染料多重標(biāo)記方法與DeCyde差異分析軟件的優(yōu)勢(shì)。DeCyder差異分析軟件利用了共找點(diǎn)檢測(cè)的算法，能對(duì)熒光圖像進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)、背景消除、定量、歸一

12、化以及凝膠內(nèi)匹配，避免了人為因素的影響，消除了不同操作者帶來的系統(tǒng)誤差。
　　基于上述思考，我們利用LPS來制作內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠模型，采用差速離心結(jié)合蔗糖密度梯度離心提取和純化了正常組和LPS刺激1h后的小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)蛋白并利用金屬磷酸鹽親和層析樹脂富集磷酸化蛋白后，采用DIGE技術(shù)對(duì)兩組磷酸化蛋白進(jìn)行分離，并建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。通過DeCyder差異分析軟件分析后找到差異蛋白點(diǎn)37個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有23個(gè)，表達(dá)下調(diào)

13、的有14個(gè)。對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，共鑒定出28種蛋白質(zhì)。對(duì)鑒定的28種蛋白質(zhì)進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)有19種蛋白為確證的磷酸化蛋白質(zhì)。
　　通過對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)作亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，我們發(fā)現(xiàn)有2個(gè)蛋白定位于細(xì)胞骨架;既可定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，又可定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有20個(gè);在其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，但是沒有定位于細(xì)胞質(zhì)的有6個(gè)。通過定位預(yù)測(cè)分析后，我們又對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這些

14、差異蛋白功能涉及分子伴侶、氧化還原酶、抗凋亡蛋白、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等。此外，采用String數(shù)據(jù)庫和軟件對(duì)所鑒定蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中8種蛋白具有直接或間接的相互作用，它們構(gòu)成一張相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。
　　通過研究，我們得出以下幾點(diǎn)結(jié)論:
　　1.差速離心法結(jié)合密度梯度離心法是提取肝臟細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的有效方法。
　　2.應(yīng)用金屬磷酸鹽親和層析樹脂成功富集了細(xì)胞質(zhì)磷酸化蛋白并利用2D DIGE分離技術(shù)分離了

15、正常和內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠(LPS1h)的肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)磷酸化蛋白，并建立了相應(yīng)的差異蛋白圖譜。通過相應(yīng)的軟件分析，得到了37個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白點(diǎn)。
　　3.對(duì)37個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，去除角蛋白污染和重復(fù)蛋白后，共鑒定出28種蛋白，其中19種蛋白是確證的磷酸化蛋白質(zhì)。
　　4.對(duì)28種差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)蛋白定位于細(xì)胞骨架;既可定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，又可定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的有20個(gè);在其它亞