內(nèi)毒素休克小鼠肝臟核蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)征候群,膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥.感染性休克是創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)后病人最主要的死亡因?yàn)橹?。統(tǒng)計(jì)表明,臨床半數(shù)的膿毒癥是由于革蘭氏陰性菌引起的,在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上的脂多糖,或稱為內(nèi)毒素,被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機(jī)體多組織器官,其中內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞,在 LPS 的刺激下,它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytoki

2、ne storm),進(jìn)而引起失控性的炎癥級聯(lián)反應(yīng),最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙。因此,膿毒癥或內(nèi)毒素休克的分子機(jī)制的研究大多聚焦在內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上,而在其它組織和器官上的相對研究較少。針對肝臟在感染性休克時(shí)介導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥相關(guān)蛋白這一復(fù)雜過程,本課題通過檢查膿毒癥及感染性休克發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中肝臟組織的變化,從分子機(jī)制上了解肝臟在這種疾病條件下所做出的反應(yīng)。
　　 本研究選用了BALB/c小鼠的肝臟作為研

3、究對象,利用LPS作為刺激因子,制備內(nèi)毒素血癥(膿毒癥主要類型)和內(nèi)毒素休克(感染性休克的主要類型)的動物模型,從而獲取這種疾病狀態(tài)下的肝臟組織。然而,選擇什么樣的研究策略對組織器官進(jìn)行有效的分子機(jī)制的研究成為本課題的關(guān)鍵。本課題是從一定的體系上來提出問題,因此可以探索用蛋白質(zhì)組學(xué)的策略來開始研究。
　　 本研究擬通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來尋找肝臟組織內(nèi)與內(nèi)毒素休克相關(guān)的蛋白質(zhì)。然而,在肝臟組織里,蛋白質(zhì)的種類相當(dāng)復(fù)雜,而且細(xì)胞外

4、基質(zhì)蛋白相當(dāng)豐富,這些蛋白與及細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)性蛋白的含量占據(jù)了肝臟蛋白質(zhì)組的主要部分,而一些功能性蛋白往往表達(dá)豐度很低,在蛋白質(zhì)組分離過程中,由于上樣量有限,高豐度蛋白的存在會使低豐度蛋白很難被檢出。所以我們希望通過提取亞細(xì)胞的蛋白質(zhì)組來富集低豐度蛋白。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組相對于全細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)組相對單純得多,解析起來相對容易,而且可以使我們研究的問題更加集中,所以我們首先選擇了細(xì)胞核來進(jìn)行研究。另外,疾病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)動態(tài)的過程,僅僅進(jìn)行

5、一個(gè)對照組和一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的差異比較很難解釋疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。因此我們需要選擇疾病發(fā)生發(fā)展過程中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)來進(jìn)行比較分析,觀察蛋白質(zhì)的動態(tài)差異。根據(jù)上述思考,我們利用LPS來制作內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠模型,分別提取LPS刺激后30 min、1h、3h和6h的小鼠及正常對照組小鼠肝臟的核蛋白來進(jìn)行研究。
　　 近年來的2-DE的新發(fā)展,熒光差異顯示雙向凝膠電泳(F-2D-DIGE)雖然具有很好組間可比性,但是在同一塊膠內(nèi)最多也

6、只能分離3組樣品,同樣不能達(dá)到本實(shí)驗(yàn)比較 5 組樣品的要求。二維高效液相色譜(2D-HPLC)是近年發(fā)展起來的蛋白分離新技術(shù),其主要的特點(diǎn)是分離過程實(shí)現(xiàn)自動化,人為的因素影響較少,分離的效果主要取決于色譜柱的柱效。其中,二維蛋白分離系統(tǒng)(PF2D)是一套新開發(fā)的2D-HPLC,其第一維色譜為高效色譜聚焦(HPCF),按蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)將樣品進(jìn)行粗分離,第二維色譜為反相高效液相色譜(RP-HPLC),按蛋白質(zhì)的疏水性對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。這套系

7、統(tǒng)的特點(diǎn)是其第一維 HPCF 色譜柱的柱體較大,上樣量高,一次可以上樣1～5 mg(2-DE 技術(shù)最多只能上樣1 mg),這對我們找到低豐度蛋白十分有利。另外,在保證柱效的前提下,PF2D可以分離多組樣品而保持較好的重復(fù)性。可以解決我們對重復(fù)性的要求。
　　 然而,目前在國際上,能夠利用PF2D進(jìn)行組織來源的樣品分離的報(bào)道尚未見到,成功分離的基本上是培養(yǎng)細(xì)胞來源的和體液的樣品。同時(shí),該系統(tǒng)在亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的成功應(yīng)用也僅局限

8、于培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白的分離。其主要原因在于蛋白提取技術(shù)與PF2D分離技術(shù)的未能實(shí)現(xiàn)良好的兼容。PF2D第一維的分離是弱陰離子交換色譜技術(shù),利用流動相形成動態(tài)的pH梯度實(shí)現(xiàn)不同等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的分離。因此,樣品溶液內(nèi)不能含有任何的鹽離子。在提取培養(yǎng)細(xì)胞的全蛋白或膜蛋白時(shí),我們可以用不含鹽離子的高含量變性劑、去污劑的裂解液來實(shí)現(xiàn)。但是對于提取組織樣品和提取亞細(xì)胞蛋白是不可行的,往往要介入高含量的鹽離子,因此需要進(jìn)行除鹽的處理。然而PF2D的第一維分

9、離對于樣品除鹽的要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)的2-DE技術(shù)。一點(diǎn)點(diǎn)的鹽離子存在都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)與色譜柱固相結(jié)合能力的下降而無法實(shí)現(xiàn)分離。我們在提取肝臟組織細(xì)胞核時(shí)介入了高濃度的鹽離子。用PF2D系統(tǒng)配套的除鹽方案進(jìn)行除鹽后,樣品分離的效果很差,pH梯度分離范圍內(nèi)幾乎檢測不到蛋白峰。為此,我們增加了除鹽強(qiáng)度,自己研制與公司提供的第一維流動相試劑兼容的超濾緩沖液,利用超濾濃縮除鹽的方法,將含鹽的核蛋白提取液更換為不含鹽的超濾緩沖液,再通過 PD-10

10、進(jìn)一步除鹽。通過不斷地對超濾緩沖液進(jìn)行優(yōu)化,終于使得PF2D分離組織來源蛋白達(dá)到了較好的效果。
　　 通過定位分析后,我們分別對蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析,利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的GO(gene ontology)功能注釋、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(domain)和模體(motif)的分析,粗略地對鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分組,歸納下來有4類:能與核酸結(jié)合的、參與氨基酸殘基修飾的、參與維持蛋白質(zhì)或核內(nèi)理化性質(zhì)穩(wěn)定的及參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的。通過這些

11、分析,我們對這群蛋白質(zhì)的認(rèn)識有了一定的條理。然而僅僅以此,還不能達(dá)到了解蛋白質(zhì)間相互關(guān)系的目的,需要對蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行預(yù)測和分析。我們利用String蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫對這60個(gè)蛋白進(jìn)行了一級相互作用(直接作用)的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)中,有3對蛋白質(zhì)是發(fā)生直接的相互作用的,其中缺眼基因同源物1(Eya1)與配位盒蛋白1(Pax1)是一對具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì),它們形成的復(fù)合物(complex)可能參與細(xì)胞凋亡的負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄機(jī)制；

12、另外一對蛋白質(zhì)是G-蛋白調(diào)節(jié)因子1(Gpsm1)和Gnas,二者形成的復(fù)合物可能參與G-蛋白信號通路。乙酰輔酶A水合酶/3-羥氨基輔酶A脫氫酶和乙酰輔酶A氧化酶2(Acox2)是一對參與乙?；磻?yīng)的蛋白質(zhì),能對賴氨酸進(jìn)行乙?；磻?yīng)。另外我們還通過Ingenuity信號通路數(shù)據(jù)庫對LPS刺激后豐度增加的蛋白質(zhì)進(jìn)行信號通路分析,結(jié)果2個(gè)通路與這群蛋白質(zhì)的比較匹配度較高,一個(gè)是參與細(xì)胞骨架重構(gòu)的,另外一個(gè)是參與免疫應(yīng)激和細(xì)胞功能維持的。上述

13、分析結(jié)果提示我們,在內(nèi)毒素休克進(jìn)程中,肝臟核內(nèi)有可能發(fā)生核骨架重構(gòu)、免疫應(yīng)激；做出這些反應(yīng)的同時(shí),還加強(qiáng)了核內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的維護(hù),防止毒性金屬離子和過氧化物損傷,在增加轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的同時(shí),加強(qiáng)對DNA的保護(hù)和修補(bǔ),抑制凋亡。
　　 另外,通過觀察鑒定的蛋白質(zhì)在PF2D等電點(diǎn)中的信息,我們發(fā)現(xiàn)一類蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)發(fā)生了變化,它們分別是睪丸H1組蛋白、組蛋白H2B型1-p、組蛋白H4、組蛋白H2A型3、這類蛋白質(zhì)是組蛋白家族成員,均為堿性蛋

14、白質(zhì),pI在10-12之間,在核內(nèi)環(huán)境里帶正電荷。然而,我們分別從pI 4.85-5.16、7.48-7.78、6.59-6.87、6.31-6.61等組分中找到這些蛋白質(zhì),同時(shí)通過蛋白質(zhì)功能信息的檢索中,還在60個(gè)鑒定的蛋白質(zhì)中找到了一些蛋白質(zhì)是參與乙?；?、磷酸化及甲基化反應(yīng)的。這些提示我們,內(nèi)毒素休克進(jìn)程中,可能通過組蛋白密碼機(jī)制,肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄加強(qiáng),對刺激做出適應(yīng)性的反應(yīng)。
　　 通過研究,我們得到以下結(jié)論:
　　

15、 1.研制了與SB相兼容的超濾緩沖液,使用超濾濃縮除鹽與 PD-10 除鹽相結(jié)合的方法,加強(qiáng)樣品除鹽處理；聯(lián)合使用0.45 μm和0.22 μm濾器對蛋白樣品進(jìn)行除顆粒處理,使樣品制備得以優(yōu)化。實(shí)現(xiàn)蛋白提取技術(shù)與離子交換色譜分離技術(shù)的兼容,突破了PF2D難以應(yīng)用于組織樣品的技術(shù)難關(guān)。
　　 2.在PF2D分離操作中,加強(qiáng)蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性,強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性,優(yōu)化PF2D分離工作模式,從而成功地實(shí)現(xiàn)多組蛋白質(zhì)樣品分離的良好可比

16、性,達(dá)到了動態(tài)差異蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)要求。
　　 3.建立了正常和內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠多時(shí)間點(diǎn)(30min、1h、3h、6h)肝臟核蛋白PF2D圖譜和兩兩比較的DeltaVue 差異圖譜及5組比較的線形差異圖譜。
　　 4.在正常和內(nèi)毒素休克BALB/c小鼠肝臟核蛋白差異圖譜中選取了503個(gè)差異蛋白峰,選取其中的50個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果鑒定出60個(gè)差異蛋白。
　　 5.對60個(gè)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)

17、測出3個(gè)直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和繪制了2個(gè)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路圖。功能事件分析表明內(nèi)毒素休克小鼠肝臟細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生了核骨架重構(gòu),加強(qiáng)了核內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的維護(hù),在增加轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的同時(shí),加強(qiáng)了對DNA的保護(hù)和修補(bǔ),抑制凋亡,參與免疫應(yīng)激反應(yīng)。
　　 6.發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素休克BALB/c肝臟細(xì)胞核內(nèi)組蛋白等電點(diǎn)發(fā)生了酸化改變,找到了一些具有對蛋白質(zhì)進(jìn)行乙?；⒘姿峄?、甲基化修飾功能的蛋白質(zhì)和復(fù)合物。提示組蛋白密碼可能是內(nèi)毒素休克小鼠肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)錄