內(nèi)毒素休克小鼠肝臟線粒體差異蛋白質(zhì)組的鑒定.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng)癥候群，膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥-感染性休克(septic shock)是創(chuàng)傷、燒傷和手術(shù)后病人最主要的死亡原因之一。統(tǒng)計(jì)表明，臨床半數(shù)的膿毒癥是由革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)引起的，在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或稱為內(nèi)毒素(endotoxin)，被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌引起膿毒癥的主要作用分子。LPS廣泛作用于機(jī)體

2、多組織器官，其中內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞，在LPS的刺激下，它們產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，即”細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)，進(jìn)而引起失控性的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷和多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction，MOD)。
　　 過去十年，研究者們致力于研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，并用內(nèi)毒素抗體和腫瘤壞死因子等炎癥因子的拮抗劑進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)，但

3、均未收到滿意的效果，至今膿毒癥的死亡率仍居高不下。這都提示我們對(duì)膿毒癥特別是內(nèi)毒素休克的認(rèn)識(shí)還有待加深。越來越多的證據(jù)顯示重要器官的線粒體損傷在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色，但是其病理生理過程的分子機(jī)制仍然未明確。
　　 線粒體(mitochondria)是真核細(xì)胞非常重要的細(xì)胞器，被譽(yù)為“細(xì)胞能量發(fā)動(dòng)機(jī)”。一般呈粒狀或桿狀，也可呈環(huán)形、啞鈴形或其他形狀，其主要化學(xué)成分是蛋白質(zhì)和脂類。線粒體由內(nèi)外兩層膜封閉，包括外膜、內(nèi)

4、膜、膜間隙和基質(zhì)四個(gè)部分。它在細(xì)胞內(nèi)的分布一般是不均勻的，根據(jù)細(xì)胞代謝的需要，線粒體可在細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)動(dòng)、變形和分裂增殖。其主要功能是進(jìn)行氧化磷酸化來合成ATP，為細(xì)胞生命活動(dòng)提供直接能量。線粒體除了為細(xì)胞提供能量外，還在細(xì)胞內(nèi)氧自由基的生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　 許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，線粒體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的改變與人類許多疾病相關(guān)，如退行性疾病、心臟病、衰

5、老和癌癥。尤其是在神經(jīng)退行性疾病方面，線粒體蛋白質(zhì)的研究日益受到關(guān)注。
　　 內(nèi)毒素休克早期究竟線粒體發(fā)生了哪些功能事件?其具體分子機(jī)制如何?目前所知有限。這些問題的解答，對(duì)從分子水平加深膿毒癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)是有益的。然而內(nèi)毒素休克過程中線粒體發(fā)生的功能事件最終是由蛋白質(zhì)來執(zhí)行的。是哪些蛋白發(fā)生了改變呢?差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以揭開這一神秘的面紗。
　　 差異蛋白質(zhì)組學(xué)能通過比較樣本間蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，尋找差異分子，用

6、以解決各種各樣的生物學(xué)問題。差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的不斷革新使得從整體上研究線粒體蛋白質(zhì)組在生理、病理過程中的變化成為可能。目前己涌現(xiàn)出許多新穎的差異蛋白質(zhì)組分析方法，其中熒光差異凝膠電泳(difference gelelectrophoresis，DIGE)技術(shù)由于繼承了二維凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)的高分辨率，同時(shí)又具備高重現(xiàn)性、高靈敏度、高通量和高動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)勢(shì)，使得DIGE

7、日益受到關(guān)注，成為最受歡迎的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段之一。
　　 DIGE是一種在2-D電泳之前進(jìn)行熒光染料標(biāo)記蛋白樣品的方法，通過對(duì)不同的蛋白樣品用不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，在同一塊雙向凝膠中可同時(shí)分離多至三種不同的蛋白樣品，并且每塊膠上又引用了內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)的利用進(jìn)一步增加可信度，確保結(jié)果能反映出真實(shí)的生物學(xué)差異，避免了系統(tǒng)誤差實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而能夠?qū)悠烽g蛋白質(zhì)豐度差異進(jìn)行精確分析。DIGE系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是整合了CyDye D

8、IGE染料多重標(biāo)記方法與DeCyder2D差異分析軟件的優(yōu)勢(shì)。DeCyder2D差異分析軟件利用了共找點(diǎn)檢測(cè)的算法，能對(duì)熒光圖像進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)、背景消除、定量、歸一化以及凝膠內(nèi)匹配，避免了人為因素的影響，消除了不同操作者帶來的系統(tǒng)誤差。既然DIGE具有如此多的優(yōu)點(diǎn)，那么利用此技術(shù)平臺(tái)將有很大機(jī)遇來揭示內(nèi)毒素休克小鼠肝臟線粒體差異蛋白質(zhì)組所蘊(yùn)藏的信息，為深入研究膿毒癥的分子機(jī)制提供新的方法。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先建立了一套基于熒光差異雙

9、向電泳分離技術(shù).基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時(shí)間/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀鑒定技術(shù)(matrix assisted laser desorptionionization-time of flight/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF)-生物信息學(xué)分析技術(shù)(bioinformatics)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，并且對(duì)其靈敏度和重現(xiàn)性進(jìn)行了考察。然后復(fù)制了BALB/c小鼠內(nèi)毒素休克模型，取

10、LPS刺激1小時(shí)(hour，hr)組和正常對(duì)照組小鼠，麻醉后取其肝臟，利用差速離心和密度梯度離心方法來提取純化肝臟線粒體，并裂解得到線粒體的全蛋白，用DIGE技術(shù)建立了內(nèi)毒素休克早期小鼠肝臟線粒體差異蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，通過DeCyder2D差異分析軟件分析后找到差異蛋白點(diǎn)26個(gè)，表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的各13個(gè)。對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，共鑒定出22種蛋白質(zhì)。
　　 這些差異蛋白的同時(shí)出現(xiàn)，必定意

11、味著它們之間有著直接或間接的聯(lián)系，如何找到它們之間的聯(lián)系，并且挖掘出這些聯(lián)系在內(nèi)毒素休克肝臟線粒體中的病理生理學(xué)意義，得出一個(gè)框架性的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步深入的研究指明道路，這也是目前功能蛋白質(zhì)組學(xué)十分關(guān)注和亟待解決的問題。而生物信息學(xué)(bioinformatics)可以作為解決這個(gè)問題的有用工具。我們首先對(duì)鑒定的差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，利用亞細(xì)胞定位軟件WoLF PSORT進(jìn)行檢索。結(jié)果完全定位于線粒體內(nèi)的有2個(gè)；既可定位于線粒體內(nèi)，又

12、可定位于胞漿的有8個(gè)；既可定位于線粒體內(nèi)，又可定位于其它多個(gè)亞細(xì)胞器的有6個(gè)；在其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，但是沒有定位于線粒體內(nèi)的有10個(gè)。這也說明線粒體的提取是成功的。
　　 通過定位分析后，我們分別對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(domain)和模體(motif)的分析，粗略地對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分組，把這些差異蛋白功能主要?dú)w納為以下5類：參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝；參與能量代謝；參與氧自由基生成調(diào)節(jié)；參與細(xì)胞凋

13、亡；參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 然而僅僅以此，還不能達(dá)到了解蛋白質(zhì)間相互關(guān)系的目的，還需要對(duì)蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。我們利用String蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這22種蛋白進(jìn)行了一級(jí)相互作用(直接作用)的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)中，有2組蛋白質(zhì)是發(fā)生直接的相互作用的。其中一組是非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Sterolcarrier protein2，Scp-2)與植烷酸氧化酶(lupus nephritis-associated p

14、eptide1，Ln1)，這兩個(gè)蛋白均在線粒體內(nèi)有定位，在LPS刺激1小時(shí)后線粒體內(nèi)均表達(dá)下調(diào)，且下調(diào)倍數(shù)一致，為-2.0左右。這兩個(gè)蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物可能參與維持脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)。另外一組是白蛋白(serum albumin，Alb)、α-1-抗胰蛋白酶1-1(α-1-antitrypsin1-1，Aat2)和甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白(Transthyretin，Ttr)，它們?cè)贚PS刺激1小時(shí)的線粒體內(nèi)含量同時(shí)上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)均在2.0

15、左右。通過軟件預(yù)測(cè)三者都定位在血漿中，在線粒體內(nèi)沒有定位，而通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)Ttr在炎癥刺激下的血漿中是表達(dá)量減少的，而我們?cè)诰€粒體內(nèi)卻出現(xiàn)了三者含量同時(shí)增加的現(xiàn)象，這是一個(gè)非常有意義的發(fā)現(xiàn)。我們推測(cè)在LPS刺激下三者可能以某種功能復(fù)合物的形式由血漿轉(zhuǎn)位入線粒體，參與細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的應(yīng)激反應(yīng)。
　　 通過研究，我們得出以下五點(diǎn)結(jié)論：
　　 1.建立了DIGE技術(shù)平臺(tái)，為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種高可信度、高重復(fù)

16、性的技術(shù)系統(tǒng)。
　　 2.成功提取并純化得到小鼠肝臟線粒體，并進(jìn)行透射電鏡驗(yàn)證。
　　 3.建立了正常和內(nèi)毒素休克早期BALB/c小鼠肝臟線粒體蛋白質(zhì)組的差異雙向電泳圖譜。
　　 4.用差異軟件分析得到26個(gè)差異蛋白點(diǎn)，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果鑒定出22種差異蛋白質(zhì)。
　　 5.對(duì)22種差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)出2個(gè)有直接相互作用的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
　　 通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的探索，我們建