水禽呼腸孤病毒感染番鴨肝臟的差異蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、水禽呼腸孤病毒病包括番鴨呼腸孤病毒?。ㄋ追Q“番鴨肝白點病”，Muscovy duck reovirusis，MDR）和新型鴨呼腸孤病毒?。ㄋ追Q‖鴨出血壞死性肝炎‖，Novel duck reovirusis， NDR）均是近年我國新出現(xiàn)的危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病，但這兩者的致病性差異較大，致病差異機理不明。本研究首次應用差異蛋白質(zhì)組學分別研究MDRV和NDRV感染雛番鴨的肝臟蛋白質(zhì)組差異，為深入研究兩種病毒之間的致病機理奠定良好理論基礎(chǔ)。<

2、br>　　1.番鴨人工感染實驗
　　4日齡健康番鴨隨機分成MDRV感染組、NDRV感染組和正常對照組，同等條件下隔離飼養(yǎng)。其中MDRV感染組腿肌接種0.2mL MDRV細胞毒；NDRV感染組腿肌接種0.2mL NDRV細胞毒；正常對照組腿肌接種0.2mL Hank’s液。分別采集接種病毒/Hank’s液1、3、4、5、6d后的肝臟并凍存于-70℃，同時觀察記錄肝臟的病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在攻毒后第3d兩組番鴨肝臟都出現(xiàn)輕微病變和癥狀，

3、第5d MDRV組番鴨肝臟見大量白色壞死點，NDRV組番鴨肝臟見大量出血點/斑或出血灶，本研究選用攻毒后病變最典型的第5d番鴨的肝臟為樣品。
　　2.番鴨肝臟二維雙向凝膠電泳條件的建立和優(yōu)化
　　本研究對不同裂解液、不同上樣量和相應的聚焦程序進行優(yōu)化，確立了番鴨肝臟二維雙向電泳凝膠技術(shù)：研磨-超聲-裂解液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，65mM DTT，40mM Tris-base，0.5% IPG buffer)法提

4、取肝臟蛋白質(zhì)；上樣時使用2D clean-up kit以及去拖尾DeStreak試劑；上樣量為1100μg；一向等電聚焦程序為：50V12 h、200V1.5 h、500V1 h、1000V1 h、8000V3 h、8000V60000 Vh、500V10h；采用膠體考馬斯亮藍染色方法染色。
　　3.MDRV和對照組之間的番鴨肝臟差異蛋白質(zhì)
　　通過二維雙向凝膠電泳技術(shù)和PDQest8.0軟件分析獲取49個MDRV試驗組與對

5、照組之間的差異表達蛋白，之后運用 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀得到這些膠點蛋白的質(zhì)量譜圖，最后運用蛋白質(zhì)搜索鑒定軟件Mascot2.3.02鑒定蛋白，結(jié)果共鑒定出38個差異表達蛋白，包括10個表達下調(diào)的蛋白、17個表達上調(diào)的蛋白、7個僅在正常番鴨肝臟里表達的蛋白和4個僅在感染MDRV的番鴨肝臟里表達的蛋白。
　　4.NDRV和對照組之間的番鴨肝臟差異蛋白質(zhì)
　　步驟同3，獲取32個NDRV試驗組與對照組之間的差異表達蛋白

6、，進一步鑒定后共有26個，包括9個表達下調(diào)的蛋白、12個表達上調(diào)的蛋白、3個僅在正常番鴨肝臟里表達的蛋白和2個僅在感染NDRV的番鴨肝臟里表達的蛋白。
　　5.MDRV和NDRV的番鴨肝臟差異蛋白點分析
　　由于鴨的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫信息不全，因此本研究運用NCBI下載的鳥綱蛋白庫構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫和Panther Classification System數(shù)據(jù)庫對上面兩組共64個蛋白展開進一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白都是

7、預測蛋白，其中有4個未知蛋白。兩組可以進行亞細胞定位的蛋白分別占16.22%、3.70%。對差異表達蛋白的分子功能分析發(fā)現(xiàn)，MDRV組和 NDRV組中具有結(jié)合功能和具有催化活性的蛋白最可能受到番鴨呼腸孤病毒感染的影響，肝臟中的代謝和抗氧化活性的變化可能是發(fā)病番鴨肝臟特點之一。
　　分析MDRV組和NDRV組中的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)MDRV組中的蛋白主要反映神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉細胞受到損傷，而 NDRV組中的蛋白主要反映肝細胞受損。兩組都有