中國禽呼腸孤病毒番鴨分離株的純化及其核酸與結(jié)構(gòu)蛋白分析.pdf

1、本試驗以S1133為參考株，對國內(nèi)分離自番鴨的呼腸孤病毒株(DRV-YH)進(jìn)行病毒純化及其核酸與結(jié)構(gòu)蛋白分析，從分子水平上對該國內(nèi)番鴨分離株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定并比較兩者是否存在差異。 方法：國內(nèi)番鴨分離株(DRV-YH)首先利用固體培養(yǎng)基在番鴨成纖維細(xì)胞(DEF)上克隆純化3次，然后用199培養(yǎng)液在雞成纖維細(xì)胞(CEF)上增殖，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)3次凍融；采取差速離心、超速離心、非線性蔗糖密度梯度離心和脫糖處理相結(jié)合的方法進(jìn)行提純；

2、不同梯度區(qū)帶的蛋白提取物經(jīng)電鏡觀察、毒價(TCID50)和含量(D值)測定得到病毒純化物；最后對病毒純化物進(jìn)行瓊脂糖核酸電泳和SDS-PAGE蛋白電泳分析。 結(jié)果：國內(nèi)番鴨分離株(DRV-YH)經(jīng)三次克隆得到病毒克隆株(記為DRV-YJL)。兩種病毒株(DRV-YJL和S1133)經(jīng)增殖培養(yǎng)收獲的病毒懸液TCID50值分別達(dá)106.5/0.02ml和108.0/0.02ml。經(jīng)純化后的DRV-YJL和S1133在20-35％和3

3、5-50％區(qū)帶上分別得到兩種蛋白提取物，其中在35-50％區(qū)帶上的蛋白提取物中觀察到大量球形、無囊膜、雙層衣殼，直徑約為60-80nm病毒粒子。同時測得DRV-YJL和S1133在35-50％區(qū)帶上的純化病毒毒價(TCID50)分別為108.8/0.02ml和1010.3/0.02ml。國內(nèi)番鴨分離株經(jīng)核酸電泳分析得到10條RNA帶，分列呈“334”形式的三組，它與參考株S1133比較，兩者在核酸電泳遷移率上除M3基因外無明顯差異；經(jīng)S