禽(番鴨)呼腸孤病毒TaqMan探針熒光RT-PCR診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、番鴨呼腸孤病毒感染是近幾年在中國(guó)福建、浙江、江蘇、廣東等中國(guó)南方番鴨飼養(yǎng)區(qū)出現(xiàn)的一種新的番鴨疫病，又稱為番鴨肝白點(diǎn)病，俗稱“肝白點(diǎn)病”或“花肝病”，是一種以軟腳為臨床特征的急性傳染病。其發(fā)病率和死亡率較高，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種切實(shí)可行且快速的診斷方法越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外水禽養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注。 本課題以本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的番鴨呼腸孤病毒YB分離株為研究材料，采用TaqMan探針?lè)?，建立了針?duì)番鴨呼腸孤病毒的實(shí)

2、時(shí)熒光RT-PCR診斷方法并進(jìn)行了初步應(yīng)用。本試驗(yàn)研究包括： 1.對(duì)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR診斷方法反應(yīng)條件的優(yōu)化 用番鴨胚擴(kuò)增病毒，提取病毒核酸，用該核酸對(duì)反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)試驗(yàn)表明，退火/延伸溫度用57℃，上游引物和下游引物終濃度都為0.7uM，TaqMan探針的終濃度為0.5uM時(shí)，可以獲得較佳的CT值及DeltaRn值。 2.標(biāo)準(zhǔn)品的制備及重復(fù)性試驗(yàn) 將RT-PCR所得到的目的片段切膠回收后，將

3、回收片斷連接PMD18-TVector，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)重組菌，然后提取重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)?？勺鰹樵撛\斷方法的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，且重組菌易于保存，重組質(zhì)粒容易獲得，這樣比保存病毒更為方便。測(cè)出重組質(zhì)粒的濃度及其拷貝數(shù)，將其稀釋到1.0×1010，做為標(biāo)準(zhǔn)品保存。將該標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋后，選取3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度做4次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果表明其變異系數(shù)較小，穩(wěn)定性良好。 3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

4、 將標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋后選取5個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度做4個(gè)重復(fù)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(Slope)為-3.1，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.994，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較好。 4.應(yīng)用 該診斷方法的靈敏度較高，至少能檢測(cè)到100拷貝/uL的標(biāo)準(zhǔn)品，比普通的PCR靈敏度高100倍。通過(guò)對(duì)該方法的特異性試驗(yàn)表明，該診斷方法不受鴨其它常見(jiàn)病毒的干擾。通過(guò)人工攻毒雛番鴨，對(duì)其肝臟組織進(jìn)行檢測(cè)，檢出率達(dá)到100％。應(yīng)用該診斷方法