新型番鴨呼腸孤病毒σC蛋白抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、禽呼腸孤病毒σC蛋白是病毒外殼蛋白的主要成分，位于病毒表面，是病毒型特異性抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，與病毒及病毒的吸附、增殖和合胞體的形成有關(guān)，能夠產(chǎn)生CPE，引起細(xì)胞凋亡。因此，σC蛋白是建立抗體檢測(cè)方法的重要目標(biāo)蛋白。
　　新型番鴨呼腸孤病毒從2001年開始出現(xiàn)，主要分布在在浙江、江蘇、福建、廣東和廣西等地，鴨鵝主要發(fā)生以肝、脾出現(xiàn)大量出血性壞死灶為特征，又被稱為“出血性壞死性肝炎”，發(fā)病日齡以5～10齡為主，死亡

2、率在2％～15％，各品種鴨（如番鴨、麻鴨、北京鴨等）和鵝均可感染。新型番鴨呼腸孤病毒與經(jīng)典番鴨呼腸孤病毒同屬于呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬，禽呼腸孤病毒群。
　　本研究利用新型番鴨呼腸孤病毒基因組模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增σC基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pET-28a(+)載體中，得到pET-28a-σC重組載體，通過E coli原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，得到大小為36kDa的σC蛋白，并且通過蛋白免疫印跡分析與間接免疫熒光對(duì)σC蛋

3、白的抗原特性進(jìn)行初步分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新型番鴨呼腸孤病毒σC蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　將純化后的新型番鴨呼腸孤病毒σC重組蛋白作為包被抗原，通過優(yōu)化篩選，確定了最適抗原包被濃度、最適封閉條件、最適血清稀釋度、血清最適作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗最適稀釋度和最適作用時(shí)間及底物最適顯色時(shí)間，建立了檢測(cè)新型番鴨呼腸孤病毒的間接ELISA檢測(cè)方法。包被抗原與坦布蘇病毒、番鴨呼腸孤病毒、禽流感H5N1和H9N2、番鴨細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒陽性血清不