表達(dá)禽（番鴨）呼腸孤病毒σC、σB蛋白基因DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力監(jiān)測.pdf

1、禽(番鴨)呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是新近發(fā)現(xiàn)的番鴨“肝白點(diǎn)病或花肝病”的病原。該病的主要臨床特征是精神萎頓、軟腳、排綠色帶有粘液稀糞、部分病鴨趾關(guān)節(jié)或跗關(guān)節(jié)有不同程度的腫脹及耐過鴨生長發(fā)育受阻；主要病理變化為肝、脾表面有多量小白點(diǎn)、腎臟腫大、出血、表面有黃色條斑。在患病番鴨中，雛番鴨最為易感，死亡率很高。 番鴨呼腸孤病毒(MuSCOVy duck reovirus，DRV)是呼腸孤病毒屬(

2、Reovirusgenus)第1I亞群中禽呼腸孤病毒(Avian reovirus)的成員，具有禽類呼腸孤病毒的共同特性。臨床該病主要見于番鴨，夏季多發(fā)，發(fā)病日齡4～45日齡，發(fā)病率20％～90％，死亡率差異很大，一般10％～30％，應(yīng)激或混合感染時(shí)高達(dá)90％以上，耐過番鴨生長發(fā)育遲緩、成為僵鴨，嚴(yán)重危害到番鴨養(yǎng)殖的健康發(fā)展，僅我省莆田縣2000年因該病死亡番鴨即達(dá)2000萬羽以上，番鴨養(yǎng)殖業(yè)受到沉重打擊。 該病毒的福建分離株Y

3、B株的S3(1104bp)與S40RF2(810bp)基因，分別編碼病毒的外衣殼蛋白σ B和吸附蛋白σ C，利用該基因作為免疫原可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異中和抗體。因此，如果能利用其這一特性研制DNA疫苗將為禽(番鴨)呼腸孤病毒的免疫預(yù)防提供新的途徑。 為了研究s3與S40RF2基因DNA疫苗，我們以含CMV啟動子一增強(qiáng)子的pCI質(zhì)粒，分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCIS3和pCIS4ORF2，并且分別通過PCR鑒定和酶切鑒定，結(jié)果表明：本試

4、驗(yàn)成功構(gòu)建了pCIS3基因DNA疫苗質(zhì)粒和pCIS40RF2基因DNA疫苗質(zhì)粒。 我們建立間接ELISA方法以檢測禽(番鴨)呼腸孤病毒抗體。制備了陽性血清(瓊擴(kuò)效價(jià)為1:16)、陰性血清、二抗(兔抗番鴨)陽性血清(瓊擴(kuò)效價(jià)為1：128)，提純二抗并標(biāo)記HRP酶，獲得合格的酶標(biāo)二抗。建立了間接ELISA檢測方法：抗原稀釋40倍，酶標(biāo)二抗稀釋400倍，血清稀釋40倍，臨界值為0.5。結(jié)果判定：以能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的血清最高稀釋度為該血清

5、的終點(diǎn)抗體滴度。 為了監(jiān)測單獨(dú)、聯(lián)合使用DNA疫苗對免疫番鴨形成免疫保護(hù)效果，分別以pcIS3、pCIS40RF2、pcIs3+pCIS40RF2，100μg的免疫劑量分別肌肉注射免疫2日齡番鴨，對照番鴨則以PBS肌肉注射免疫。首次免疫1周后以相同劑量和途徑加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后1周后用TCID<,50>為10<'-7.1934>/0.1ml病毒液肌肉注射攻毒，攻毒量為：0.2ml/只，觀察發(fā)病與死亡情況，同時(shí)檢測免疫后、攻毒前及

6、攻毒后血清抗體滴度的動態(tài)變化。 結(jié)果：除對照組外，所有免疫組在加強(qiáng)免疫后攻毒前抗體均轉(zhuǎn)陽，并且抗體滴度水平都在1：20以上，攻毒后聯(lián)合免疫組最高滴度水平達(dá)到1:320，而其他組滴度水平則為1:160。100μg劑量免疫，pcIS3+pcIS40RF2聯(lián)合可對免疫番鴨形成100％完全保護(hù)，個(gè)別發(fā)病，但不死亡；100μg劑量免疫，pCIs3可對免疫番鴨形成80％保護(hù)，較多發(fā)病；100μg劑量免疫，pcIS40RF2對免疫番鴨形成90

7、％保護(hù)，個(gè)別發(fā)病。實(shí)驗(yàn)證明pCIs3+pCIS40RF2聯(lián)合免疫效果比單獨(dú)使用pCIS3或pCIS40RF2免疫效果好。 為了探索免疫佐劑的添加對免疫效果的影響，選擇免疫效果較好的pCIS3+pCIS40RF2聯(lián)合基因疫苗，分別采用添加適量的白油、甘油、氫氧化鋁佐劑免疫方法免疫，免疫程序同第一次動物實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：所有免疫組在加強(qiáng)免疫后攻毒前抗體均轉(zhuǎn)陽，并且抗體滴度水平都在1：40以上，攻毒后添加白油佐劑聯(lián)合免疫組最高達(dá)到