狂犬病毒感染的神經(jīng)細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究及伴侶素CCTγ的功能分析.pdf

1、狂犬病毒(Rabies virus，RV)屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬的單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，具有高度嗜神經(jīng)性和致死性?；蚪M全長約為12kb，分別編碼糖蛋白(G)、核蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)。目前對該病毒與宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制認(rèn)識(shí)相對有限，致病機(jī)制仍不甚明了。本研究對RV感染的宿主細(xì)胞差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，旨在為探討RV對宿主細(xì)胞的致病作用和尋找潛在的藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
　　 單克隆抗體是疾

2、病診斷、預(yù)防、治療以及免疫機(jī)制研究的有力武器，除商業(yè)化的糖蛋白單克隆抗體，無針對RV其他蛋白的單克隆抗體。本研究將RV核蛋白重組表達(dá)載體pET32a-NP和糖蛋白重組表達(dá)載體pET32a-GP分別誘導(dǎo)表達(dá)，用變性純化的表達(dá)蛋白免疫BALB/c小鼠，成功制備了9株抗RV核蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞和1株抗RV糖蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。同時(shí)，通過以自制的狂犬病毒感染乳鼠腦組織懸液為抗原免疫小鼠，取脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合，成功獲得了7株

3、為抗RV磷蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
　　 為了探索病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，本研究選擇鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2a為感染模型，采用二維凝膠電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定的經(jīng)典比較蛋白組學(xué)方法，分析了N2a細(xì)胞在感染RV后24h、48h和96h的差異蛋白表達(dá)譜。PDQuest軟件分析結(jié)果顯示，RV感染N2a細(xì)胞后，共出現(xiàn)了97個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)主要出現(xiàn)在感染后48h和96h，且多數(shù)蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢。串聯(lián)質(zhì)譜MALDI-T

4、OF/TOF對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，成功鑒定出對應(yīng)49種差異蛋白的53個(gè)蛋白點(diǎn)。這些差異蛋白的功能涉及蛋白合成與加工、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)/伴侶蛋白、基因調(diào)控、免疫反應(yīng)和泛素——蛋白酶體通路。設(shè)計(jì)引物，并通過適時(shí)熒光定量PCR對其中的27個(gè)差異蛋白對應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄本的變化進(jìn)行了驗(yàn)證，一定程度上確證了質(zhì)譜鑒定結(jié)果的可靠性。免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了HSP90和CCTγ在感染組和對照組中上調(diào)表達(dá)的差異。針對差異表達(dá)蛋白，基于Ingenuity生物

5、網(wǎng)絡(luò)分析軟件IPA繪制了這些差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。上述差異表達(dá)蛋白信息和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)為進(jìn)一步解析狂犬病發(fā)病機(jī)制提供了重要的蛋白組學(xué)信息。
　　 依據(jù)比較蛋白組學(xué)信息，采用間接免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)進(jìn)一步分析了RV感染細(xì)胞CCTα、CCTβ、CCTγ、HSP90、PFDN1和DLC8的亞細(xì)胞分布。結(jié)果表明，病毒感染引起了細(xì)胞CCTα和CCTγ蛋白在內(nèi)氏小體部位的高度募集，PFDN1和DLC8在該部位的部分聚集，CCTα和CCTγ與

6、病毒N、P蛋白能夠很好的共定位;而CCTβ和HSP90則無明顯的內(nèi)氏小體部位募集現(xiàn)象。共轉(zhuǎn)染RVN和P的細(xì)胞內(nèi)也形成類似內(nèi)氏小體的結(jié)構(gòu)，且在該結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)與感染細(xì)胞類似的現(xiàn)象，CCTγ、CCTα、PFDN1和DLC8與內(nèi)氏小體中N、P蛋白發(fā)生共定位。單獨(dú)轉(zhuǎn)染N或P的細(xì)胞中也出現(xiàn)不同程度的CCT和CCTα與N或P的共定位。熒光定量結(jié)果表明感染細(xì)胞中DLC8、CCTγ和HSP90均呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而CCTα、CCTβ、PFDN1則變化不明顯;

7、而P質(zhì)粒單轉(zhuǎn)以及與N質(zhì)粒共轉(zhuǎn)N2a細(xì)胞引起了DLC8的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，這可能與P和DLC8的相互作用有關(guān)，而其他蛋白則變化不顯著。這都說明，這些宿主細(xì)胞蛋白主動(dòng)或被動(dòng)的參與了病毒的生命活動(dòng)。
　　 鑒于CCTγ在蛋白組學(xué)上的表達(dá)差異及亞細(xì)胞定位上的分布變化，有必要對其在狂犬病毒生命周期中的具體功能進(jìn)行探索。本研究通過慢病毒介導(dǎo)的shCCTγ、shCCTα和無義序列shcoo2v的轉(zhuǎn)導(dǎo)建立了穩(wěn)定表達(dá)shCCTγ、shCCTα的RNA