狂犬病病毒粒子的蛋白質(zhì)組及與N和P蛋白互作宿主蛋白的鑒定.pdf

1、狂犬病是一種嚴(yán)重侵害大腦中樞神經(jīng)的重要人獸共患傳染病，是由狂犬病病毒所引起的，可感染所有的溫血動物并引起致死性的腦脊髓炎，其病死率高達(dá)100％。據(jù)WHO報道全世界每年近6萬人死于狂犬病，而這主要發(fā)生在發(fā)展中國家，其中亞洲和非洲占絕大多數(shù)。我國是狂犬病高發(fā)地區(qū)，近幾年因狂犬病發(fā)病死亡的人數(shù)每年都高達(dá)數(shù)千人，且還有上升的趨勢，我國狂犬病發(fā)病和死亡人數(shù)已居世界第二位，僅次于印度。因此，預(yù)防和治療狂犬病的任務(wù)迫在眉睫且十分艱巨。
　　狂犬

2、病病毒是一個具有囊膜的不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，是彈狀病毒科狂犬病病毒屬成員，主要編碼核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)等五個結(jié)構(gòu)蛋白。病毒粒子呈子彈狀，外部為脂質(zhì)雙層囊膜，其表面含G蛋白纖突，主要參與介導(dǎo)細(xì)胞膜融合、受體結(jié)合以及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，此外還與病毒毒力及致病性有關(guān)。M蛋白位于病毒囊膜內(nèi)側(cè)，可將核衣殼和囊膜連接起來，主要參與子代病毒的裝配和出芽及病毒形態(tài)的形成。內(nèi)部包裹由N蛋白、

3、P蛋白、L蛋白及病毒基因組RNA組成的核衣殼，即核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，作為狂犬病病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的模板。N蛋白主要與狂犬病病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)，在病毒的復(fù)制過程中與基因組RNA緊密結(jié)合形成N-RNA復(fù)合物，保護(hù)病毒核酸被水解且使其所在的核衣殼處于轉(zhuǎn)錄所需的螺旋對稱結(jié)構(gòu)。P蛋白與病毒在宿主細(xì)胞中成功復(fù)制具有重要作用，可作為一種干擾素的拮抗劑。L蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過程中具有十分重要的催化作用。
　　狂犬病病毒粒子從感染的細(xì)胞中

4、出芽釋放時會攜帶許多可能在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用的宿主蛋白，這些可能是由于病毒出芽時與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合而被攜帶出來并位于囊膜表面，也可能是由于與N蛋白、P蛋白和L蛋白相互作用而被攜帶出來并位于囊膜內(nèi)部。因此鑒定與病毒蛋白相關(guān)的宿主蛋白，對于從分子水平上理解狂犬病病毒與宿主間的相互作用及病毒復(fù)制的分子機(jī)制具有重要作用，并且可為合理的研發(fā)狂犬病的靶向治療試劑提供有力的理論依據(jù)。
　　本研究首先在病毒培養(yǎng)和蔗糖密度梯度超離心純化的

5、基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了純化的狂犬病病毒粒子（SRV9弱毒疫苗株）上的蛋白質(zhì)組成。除了檢測到狂犬病病毒編碼的五個結(jié)構(gòu)蛋白以外，我們還檢測到了50個宿主編碼的蛋白。按功能可將其分成十類:胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白(14％)，分子伴侶(12％)，細(xì)胞骨架蛋白(24％)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(8％)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(12％)，鈣離子結(jié)合蛋白(6％)，酶結(jié)合蛋白(6％)，代謝作用蛋白(2％)，泛素化蛋白(2％)，其他功能的蛋白(14％)。利用免疫印跡方法對病毒

6、粒子上的4個宿主蛋白（肌動蛋白，微管蛋白，微絲結(jié)合蛋白和熱應(yīng)激同源蛋白70）進(jìn)行了驗證。本研究首次鑒定了狂犬病病毒粒子上的宿主蛋白組成，有助于進(jìn)一步研究該病毒復(fù)制與感染機(jī)制。
　　隨后從狂犬病病毒CVS-11毒株中擴(kuò)增得到N和P基因全長并克隆至pZeroBack/blunt載體，再將P基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株BL21(DE3)中，通過IPTG誘導(dǎo)重組P蛋白的表達(dá)，經(jīng)SDS-

7、PAGE電泳分析，可知大小約為54 kD的重組P蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。在變性的條件下，用Ni-NTA親和層析純化了重組P蛋白且純度較高。免疫小鼠后，獲得了抗P蛋白的多克隆抗體，通過間接ELISA方法檢測了其抗體效價可達(dá)到1∶32000，還通過IFA和Western Blot驗證了制備的多克隆抗體具有良好的特異性，可識別狂犬病病毒CVS-11感染BHK細(xì)胞中表達(dá)的P蛋白。制備的多克隆抗體可用于檢測篩選表達(dá)P蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，為進(jìn)一步

8、研究P蛋白的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　還利用串聯(lián)親和純化(TAP)系統(tǒng)將N和P基因亞克隆至真核表達(dá)載體pNTAP-B上，使表達(dá)的N和P蛋白氨基末端加上CBP-SBP串聯(lián)親和標(biāo)簽。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞系。經(jīng)RT-PCR、IFA及Western Blot驗證了的穩(wěn)定細(xì)胞系，分別擴(kuò)大培養(yǎng)后，收獲的細(xì)胞裂解液進(jìn)行兩步純化，篩選與N和P蛋白相互作用的宿主蛋白，純化得到的蛋白復(fù)合物經(jīng)SDS-P

9、AGE電泳及銀染，質(zhì)譜分析，去除對照組背景，分別得到與N和P蛋白相互作用宿主蛋白有41個和21個。
　　篩選的穩(wěn)定細(xì)胞系通過IFA檢測其目的蛋白在細(xì)胞中的定位，可知N蛋白主要定位于細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，而P蛋白主要定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并且還通過提取穩(wěn)定細(xì)胞系中的細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白進(jìn)行Western Blot分析，驗證了這一結(jié)果。并且通過FAT檢測篩選的穩(wěn)定細(xì)胞系中目的蛋白的表達(dá)對狂犬病病毒增殖的影響，發(fā)現(xiàn)外源的N和P蛋白的表達(dá)會抑

10、制狂犬病病毒的增殖，并且對SRV9的抑制效果強(qiáng)于CVS-11。
　　鑒于以上研究，我們通過分析狂犬病病毒粒子的蛋白質(zhì)組學(xué)，檢測到的50個宿主蛋白與TAP方法聯(lián)合質(zhì)譜分析分別篩選得到41個和21個與N和P蛋白相互作用的宿主蛋白相比，分別有9個和6個宿主蛋白存在于狂犬病病毒粒子上。還發(fā)現(xiàn)N蛋白主要定位于其穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞核內(nèi)，而P蛋白主要定位于其穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)中，同時穩(wěn)定細(xì)胞系中N和P蛋白的表達(dá)對狂犬病病毒的增殖有抑制作用，并且抑