AIV NA蛋白的體外表達及與NS1互作宿主蛋白的篩選和鑒定.pdf

1、禽流感由禽流感病毒（AIV）引起，感染雞群后會引發(fā)呼吸道疾病和產(chǎn)蛋下降，嚴重時引起死亡，是危害我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染??；同時AIV還能感染人類，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全，所以對其進行深入的研究具有重要的意義。
　　AIV具有多種亞型，并在致病力上存在明顯差異，而迅速準確的確定AIV的亞型，是采取有效措施，正確防治禽流感的前提。AIV依據(jù)其囊膜表面糖蛋白：血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異進行亞型分類。HA亞型可通過血凝抑

2、制試驗（HI）快速確定，而NA亞型的鑒定方法主要為神經(jīng)氨酸酶抑制試驗（NI），該試驗過程復雜，耗時費力，無法滿足實際需要。為構(gòu)建快速的NA亞型診斷方法，本實驗利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，分別構(gòu)建表達不同亞型NA蛋白的桿狀病毒，最終成功表達出具有生物學活性的N1-N9亞型NA蛋白。隨后，對各亞型NA蛋白的ELISA檢測條件進行了細致的摸索，為下一步構(gòu)建NA亞型的ELISA快速檢測方法奠定了基礎。
　　AIV的非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）能夠與細

3、胞中多種宿主因子相互作用，在AIV侵染病毒過程中發(fā)揮多種功能。為鑒定與NS1結(jié)合的新的宿主蛋白，本研究以AIV GD1322株感染人肺泡上皮細胞（A549），利用NS1的單克隆抗體進行免疫沉淀反應篩選宿主因子。質(zhì)譜鑒定提示NS1與膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）存在相互作用，該結(jié)果通過免疫共沉淀試驗（co-IP）得到證實。激光共聚焦試驗表明NS1與ANXA2共定位于胞漿中，進一步研究發(fā)現(xiàn)，利用siRNA敲除ANXA2后能有效抑制H5N1 AI

4、V的增殖，而過表達ANXA2后結(jié)果正好相反，表明ANXA2具有促病毒增殖作用，與NS1的功能相符，暗示兩者互作可能利于NS1發(fā)揮作用。另外，質(zhì)譜鑒定還提示NS1與人凋亡誘導因子1（AIFM1）存在相互作用，結(jié)果同樣經(jīng)co-IP得到驗證，且Pull-down試驗證明AIFM1直接與NS1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域（ED）結(jié)合，激光共聚焦試驗表明兩者共定位于胞漿中。本研究鑒定AIV NS1蛋白與宿主蛋白ANXA2、AIFM1間存在相互作用，為進一步深