與水稻CDF1蛋白互作用的蛋白篩選和分析.pdf

1、本室前期通過(guò)對(duì)T-DNA插入突變體材料篩選和鑒定，克隆到調(diào)控水稻抽穗期的一個(gè)新的重要基因CDF1(Constitutive Delayed Flowering1)。該基因編碼一個(gè)含C3HC4 RING-finger結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白的E3泛素連接酶。該基因的突變體長(zhǎng)短日照條件下均表現(xiàn)為組成型的晚抽穗表型。本研究將重點(diǎn)研究CDF1參與的水稻抽穗期調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)鑒定與CDF1蛋白互作及受CDF1調(diào)控的基因，同時(shí)

2、利用國(guó)內(nèi)外水稻突變體資源，從遺傳水平上闡釋這些基因在水稻開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的功能。本研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)觀察cdf1材料的田間表型和統(tǒng)計(jì)其抽穗期，采用基因組引物(R和F)及T-DNA引物L(fēng)BT2鑒定cdf1材料的基因型，結(jié)果與前期結(jié)果一致：cdf1材料的突變表型與T-DNA純合插入完全共分離；
　　 2.構(gòu)建CDF1基因的ds RNAi載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法成功獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；
　　 3.根據(jù)基

3、因芯片結(jié)果共挑選74個(gè)差異表達(dá)基因，采用RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)這些基因在cdf1材料和野生型植株中的表達(dá)量；結(jié)果表明：與野生型相比，在cdf1中有31個(gè)基因下降表達(dá)，26個(gè)基因上升表達(dá)，9個(gè)基因表達(dá)差異不明顯，還有8個(gè)基因沒(méi)檢測(cè)結(jié)果，大部分檢測(cè)結(jié)果與芯片結(jié)果相一致，其中很多開(kāi)花調(diào)控基因都受到CDF1基因調(diào)控；
　　 4.構(gòu)建22種融合不同長(zhǎng)度CDF1蛋白片段的pGBKT7載體，通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些C

4、DF1截短蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，并證明CDF1蛋白的181～215氨基酸區(qū)間具有自激活活性；
　　 5.分別在水稻開(kāi)花轉(zhuǎn)換之前(播種后第35 d)的10:00 P.M.和9:30 A.M.取倒二葉葉片的總RNA樣，利用SMART同源重組交換技術(shù)分別在酵母菌株AH109和Y187中成功構(gòu)建2個(gè)Y2H倒二葉葉片cDNA文庫(kù)；
　　 6.共完成3次篩庫(kù)工作，并用酵母共轉(zhuǎn)化技術(shù)驗(yàn)證篩庫(kù)結(jié)果的正確性，CDF1(99-619)篩選10:0

5、0 P.M.cDNA文庫(kù)得到21個(gè)互作蛋白；而CDF1(288-667)篩選10:00 P.M。cDNA文庫(kù)獲得22個(gè)候選互作蛋白，篩選9:30 A.M.cDNA文庫(kù)獲得21個(gè)候選互作蛋白；3次篩庫(kù)共得到54個(gè)不同的互作蛋白；
　　 7.利用酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)探索CDF1蛋白與其它開(kāi)花基因的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDF1蛋白與OsFM1蛋白互作，CDF1也與自身互作形成二聚體；
　　 8.用TAIL-PCR和APCR技術(shù)分離22