人外周血hPERIOD1相互作用蛋白的篩選.pdf

1、自然界大多數(shù)生物的生理活動均呈現(xiàn)周期約24小時的節(jié)律變化，這些現(xiàn)象稱為近日節(jié)律。哺乳動物近日節(jié)律中樞位于下丘腦視交叉上核(SCN)，其產(chǎn)生的分子機制為一系列節(jié)律基因及其表達產(chǎn)物組成的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所形成反饋環(huán)路。這些基因包括 Per1，Per2，Per3， Cry1，Cry2，Bmal1和Clock等。目前的研究發(fā)現(xiàn)，近日節(jié)律基因在一些外周組織，如肝、腎、肺等表達。Per1作為近日節(jié)律分子振蕩的核心元件，在SCN中產(chǎn)生和維持起重要作用

2、，在外周組織中也有豐富的表達。然而，迄今為止，外周組織PER1的功能尚不十分清楚。 為了完善hPer1在近日節(jié)律分子振蕩的機制，本文采用酵母雙雜交技術(shù)，以hPER1的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域為誘餌蛋白對人血液eDNA文庫進行篩選，尋找與其相互作用的新蛋白，為進一步研究hPer1的功能提供新的線索。 構(gòu)建人血液cDNA文庫。通過RT-PCR擴增hPER1-PAS結(jié)構(gòu)域的編碼序列，獲得的片斷與質(zhì)粒載體pGBKT7連接重組為誘餌

3、質(zhì)粒pGBKT7/hPer1<,PAS>。檢測轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的酵母AH109是否有自激活發(fā)生以及重組誘餌蛋白的毒性。順序轉(zhuǎn)染法構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選人血液cDNA文庫中能與誘餌蛋白hPER1-PAS結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白。采用營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、β-半乳糖苷酶印膜法檢測報告基因的表達。陽性克隆經(jīng)PCR擴增后，進行測序和生物信息學(xué)分析。 經(jīng)酶切和基因測序鑒定證實重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7/hPer1<,bHLH-PAS>構(gòu)建成功。自激活檢