重要核孔復(fù)合體蛋白NUP155相互作用蛋白的篩選.pdf

1、研究背景及目的:心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)是最常見的心律失常,其遺傳因素在房顫發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。NUP155基因突變能夠引起房顫,這是房顫的非離子通道遺傳基礎(chǔ),為房顫發(fā)病機(jī)理提供了一種新的機(jī)制。NUP155基因編碼一種核孔蛋白,其突變引起房顫的分子機(jī)制尚不清楚。有種假說(shuō)認(rèn)為NUP155蛋白是引發(fā)房顫的一個(gè)上游關(guān)鍵蛋白,可通過(guò)與其它蛋白質(zhì)的相互作用,影響基因的表達(dá)而導(dǎo)致房顫。NUP155蛋白與其他蛋白相互作用功能的缺失,可能會(huì)改變mRN

2、A和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸,進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)導(dǎo)致房顫的發(fā)生。為了驗(yàn)證這一假說(shuō),本研究將對(duì)NUP155蛋白的互作蛋白進(jìn)行篩選,以闡明NUP155蛋白在房顫發(fā)生中的作用及地位。
　　方法:本研究構(gòu)建了pET-28a-NUP155(1~10)表達(dá)載體和pET-28a-GST-TEV-NUP155(1~10)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)Rosetta,誘導(dǎo)表達(dá)后,分別使用His親和層析法和GST親和層析法進(jìn)行蛋白純化,獲得大量的

3、重組蛋白,通過(guò)GSTpull-down法,篩選HeLa細(xì)胞中NUP155蛋白潛在的互作蛋白。SDS-PAGE分離pull-down復(fù)合蛋白,并通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法鑒定pull-down互作蛋白。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了20個(gè)表達(dá)載體,分別為pET-28a-NUP155(1~10)和pET-28a-GST-TEV-NUP155(1~10)。獲得了2個(gè)高效表達(dá)融合蛋白的重組載體pET-28a-GST-TEV-NUP155(1,9