酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人TFF3相互作用蛋白研究.pdf

1、目的：應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)自胃癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選人TFF3(humantrefoil factor3，hTFF3)相互作用蛋白基因，并以反向酵母雙雜交方法驗(yàn)證候選結(jié)合蛋白。探討hTFF3在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能存在的分子作用機(jī)制。 方法：從胃癌細(xì)胞系SGC7901中提取總RNA，利用RT-PCR法擴(kuò)增hTFF3基因，將hTFF3基因定向克隆到酵母表達(dá)載體pDEST32，命名pDEST32-hTFF3，Western blot法

2、驗(yàn)證其在酵母中的表達(dá)。酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人胃癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)，提取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)正向雙雜交篩選結(jié)果，將篩選出的醛酮還原酶1C1(AKR1C1)、核不均一核糖核蛋白A1(hnRNP A1)、β-arrestin-1(ARRB1)、伴侶素TCP1-γ(CCTγ)蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并與hTFF3基因分別定向克隆到pDEST32及pDEST22載體中構(gòu)建誘餌及獵物質(zhì)粒。反向酵母雙雜交方法驗(yàn)證正向篩

3、選結(jié)果的可靠性及正確性。 結(jié)果：成功以RT-PCR法擴(kuò)增獲得hTFF3基因，構(gòu)建pDEST32-hTFF3表達(dá)載體。以hTFF3為靶基因經(jīng)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)自胃癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選后獲得了21個(gè)可能與hTFF3發(fā)生特異性相互作用的陽性克隆，12個(gè)克隆成功測(cè)序，其中6個(gè)陽性克隆的獵物載體內(nèi)插入基因?yàn)橐阎鞍谆?，分別為醛酮還原酶A1C1、核不均一核糖核蛋白A1、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)α2鏈、伴侶素TCP1-γ、β-arrestin-

4、1、硒蛋白W1，其余6個(gè)陽性克隆為未知功能基因。將篩選出的醛酮還原酶A1C1、核不均一核糖核蛋白A1、β-arrestin-1、伴侶素TCP1-γ基因與hTFF3基因進(jìn)行反向酵母雙雜交，結(jié)果證明這四種宿主多肽/蛋白可以與hTFF3發(fā)生相互作用。 結(jié)論：篩選并驗(yàn)證了四種宿主多肽/蛋白可以與hTFF3相互作用，分別為醛酮還原酶A1C1、核不均一核糖核蛋白A1、β-arrestin-1、伴侶素TCP1-γ，為hTFF3與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)